一種用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條及其制備方法技術

一種用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條及其制備方法，涉及一種檢測食源性土霉素殘留的試紙條及其制備方法。本發明專利技術為了解決現有檢測土霉素的方法操作繁瑣，樣品處理復雜，不適合現場檢測的問題。試紙條由ＰＶＣ背板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成。制備方法：一、土霉素人工抗原的合成；二、制備土霉素－載體蛋白偶聯物，制成檢測線和質控線；三、制備抗土霉素單克隆抗體；四、制備膠體金溶液，制得抗土霉素單克隆抗體－膠體金標記物，然后包被在結合墊上；五、在ＰＶＣ背板上依次粘附樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，即得到用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條。應用于食源性土霉素殘留檢測領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測食源性土霉素殘留的試紙條及其制備方法。技術背景土霉素(OTC)是常見的四環素類抗生素，分子量為460，為灰黃色結晶粉末，難溶 于水，鹽酸鹽在水中溶解度為500mg/mL，微溶于乙醇，在空氣中穩定。土霉素抗菌譜廣，對革 蘭氏陽性菌和陰性菌、立克次氏體、支原體、衣原體等原核微生物均有抑菌作用且對某些酵 母及原生動物等真核微生物也有抑制效果。由于土霉素抗菌效果好，價格低廉等優點而被廣泛應用于水產養殖業，用于多種 水產動物的細菌性疾病防治，淡水魚類爛鰓病、腸炎病、赤皮病等。但是由于養殖過程中土 霉素的長期濫用，導致了在水產品中的大量殘留，其對人體健康、生態環境、水產品貿易等 方面造成了嚴重的危害。國家農業部規定土霉素在肌肉中最高殘留限量為100 μ g/kg，在水 產品中的最高殘留限量為100 μ g/kg。目前，應用于土霉素抗生素殘留的檢測方法主要有儀器分析法和免疫分析法兩大 類。前者主要包括高效液相色譜，高效液相色譜串聯質譜等，具有精確度高、靈敏等優點，但 其存在操作繁瑣、樣品處理復雜、成本高、不適合現場檢測等缺點。酶聯免疫檢測方法所需 試劑主要依賴進口，費用較高。
技術實現思路
本專利技術是為了解決現有檢測土霉素的方法操作繁瑣，樣品處理復雜，不適合現場 檢測的問題，提供。本專利技術的一種用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條，由PVC背板、樣品 墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，在PVC背板上依次連續粘附有樣品墊、結合墊、硝 酸纖維素膜和吸收墊，所述樣品墊與所述結合墊之間有搭接，所述結合墊與所述硝酸纖維 素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊之間有搭接；所述結合墊上包被有抗土 霉素單克隆抗體-膠體金標記物，包被量為0. 1 μ g ；所述硝酸纖維素膜上分別包被有土霉 素-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和羊抗鼠IgG構成的質控線，包被量均為0. 05 μ g。上述的一種用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條的制備方法，按以下步 驟進行一、土霉素人工抗原的合成將鄰聯甲苯胺(o-Tolidine)溶解于0. 2 0. 3mol/ L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光 反應0.5 lh，得到溶液A，稱取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH值為 7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并加入上述溶液A，避光反應2 池，在0 4°C 條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析2 3天，每隔6 他換一次磷酸鹽緩沖液，透 析完成后，于5000 6000r/min條件下離心5 lOmin，棄去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA;二、制備土霉素-載體蛋白偶聯物，然后包被在硝酸纖維素膜上構4成檢測線，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構成質控線；三、制備抗土霉素單克隆抗 體；四、采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，然后將抗土霉素單克隆抗體加入膠體金 溶液中，制得抗土霉素單克隆抗體-膠體金標記物，然后包被在結合墊上；五、在PVC背板 上依次連續粘附樣品墊、步驟四所得結合墊、步驟二所得硝酸纖維素膜和吸水墊，然后切成 60mmX4mm的試紙條，即得到用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條；步驟一中每 毫克鄰聯甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克鄰聯甲苯胺加入0. 01 0. 03mL的 NaNO2溶液；步驟一中土霉素與牛血清白蛋白的質量比為1 1.5 2，硼砂緩沖液和溶液 A與土霉素的體積比分別為8 10 1和4 6 1 ；步驟二中土霉素-載體蛋白偶聯物 和羊抗鼠IgG的包被量均為0. 05 μ g ；步驟四中抗土霉素單克隆抗體-膠體金標記物的包 被量為0. 1 μ g。本專利技術的原理當待測樣品溶液滴入試劑條的加樣區后，樣品溶液因纖維素膜載 體的毛細管作用向另一端擴散。在移動過程中，會發生相應的抗原抗體反應，并通過免疫膠 體金的顏色顯示出來。如果樣品溶液中含有土霉素殘留，土霉素將與結合墊上的抗土霉素 單克隆抗體-膠體金標記物先行反應，因此當膠體金顆粒隨著樣品溶液擴散至檢測線時， 膠體金顆粒上的抗體的活性位點因被樣品溶液中的土霉素占據而無法與檢測線上土霉素 特異性抗原結合；所以當樣品中的土霉素含量超過試紙條檢出限時，試紙條上的檢測線將 較控制線顯色淡甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中土霉素含量在試紙條檢出限以下 或者無殘留時，試紙條上的檢測線顯色與控制線相近偏深，判定為陰性。本專利技術用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條特異性強，靈敏度高，檢出 限為5 μ g/kg，重復性好，使用時樣品制備簡單，檢測操作簡易，適于實地現場操作。附圖說明圖1為具體實施方式一制備的用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條的 示意圖。具體實施方式本專利技術技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的 任意組合。具體實施方式一結合圖1說明本實施方式，本實施方式用于檢測肉類及水產品 中土霉素殘留的試紙條，由PVC背板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸收墊5組 成，在PVC背板1上依次連續粘附有樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸收墊5，所述 樣品墊2與所述結合墊3之間有搭接，所述結合墊3與所述硝酸纖維素膜4之間有搭接，所 述硝酸纖維素膜4與所述吸收墊5之間有搭接；所述結合墊3上包被有抗土霉素單克隆抗 體-膠體金標記物，包被量為0. 1 μ g ；所述硝酸纖維素膜4上分別包被有土霉素-載體蛋 白偶聯物構成的檢測線T和羊抗鼠IgG構成的質控線C，包被量均為0. 05 μ g。本實施方式中的PVC背板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5均購 自上海金標生物科技有限公司。本實施方式用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條的示意圖如圖1所示。本實施方式用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條特異性強，靈敏度高，檢出限為5yg/kg。具體實施方式二 本實施方式與具體實施方式一不同的是硝酸纖維素膜4上包 被的土霉素-載體蛋白偶聯物中的載體蛋白為卵清蛋白(OVA)。其它與具體實施方式一相 同。具體實施方式三本實施方式用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條的制 備方法，按以下步驟進行一、土霉素人工抗原的合成將鄰聯甲苯胺(o-Tolidine)溶解于 0. 2 0. 3mol/L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入；35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于 4°〇，避光反應0.5 11!，得到溶液六，稱取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH 值為7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂緩沖液中，并加入上述溶液A，避光反應2 池，在0 4°C條件下用0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液透析2 3天，每隔6 他換一次磷酸鹽緩沖液， 透析完成后，于5000 6000r/min條件下離心5 lOmin，棄去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA ；二、制備土霉素-載體蛋白偶聯物，然后包被在硝酸纖維素膜4上構 成檢測線，再將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜4上構成質控線；三、制備抗土霉素單克隆 抗體；四、采用檸檬酸三鈉還本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條，其特征在于用于檢測肉類及水產品中土霉素殘留的試紙條，由ＰＶＣ背板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，在ＰＶＣ背板上依次連續粘附有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述樣品墊與所述結合墊之間有搭接，所述結合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊之間有搭接；所述結合墊上包被有抗土霉素單克隆抗體－膠體金標記物，包被量為０．１μｇ；所述硝酸纖維素膜上分別包被有土霉素－載體蛋白偶聯物構成的檢測線和羊抗鼠ＩｇＧ構成的質控線，包被量均為０．０５μｇ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔艷華，馬鶯，徐桂連，代翠紅，丁忠慶，
申請(專利權)人：哈爾濱工業大學，
類型：發明
國別省市：93[中國|哈爾濱]