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    用于診斷蝦病原體的序列制造技術

    技術編號:5428681 閱讀:338 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
    已分離了用于檢測白斑病綜合征病毒(WSSV)的診斷引物。該引物基于WSSV基因組的新部分,并可用于引物指導的擴增或核酸雜交測定方法。

    【技術實現步驟摘要】
    【國外來華專利技術】用于診斷壞病原體的序列 與相關申請的交叉引用本申請在35 U.S.C. §119下要求于2006年8月24日提交的美國臨 時申請系列號60/839744的優先權。專利
    本專利技術涉及診斷測試領域。更具體而言,已開發了用于檢測蝦白斑 病綜合征病毒病原體的新的引物。專利技術背景商業奸養殖場因為大量常見病原體的影響而遭受廣泛損失。白斑病 綜合征病毒(WSSV)可以導致商業蝦斑節對蝦(尸e朋e^ moot/o)的 迅速死亡。WSSV是雙鏈DNA桿狀病毒,其完整基因組已經得到測序 (van Hulten等人,W>o/ogy 286:7-22 (2001);以及Yang等人,丄K>o/. 75:11811-11820 (2001))。在泰國至少發現12個WSSV變種,其區別在 于可讀框(ORF)94內多個重復長度的不同。WSSV擴散迅速并且可以在兩周之內毀滅商業蝦的運作。對孵育場 孵卵原種(broodstock)和后期仔奸(post-larvae)的WSSV檢測允許將感染 蟲下在進入商業生產體系之前消除。因此,已開發了檢測奸中WSSV的多 種方法,包括基于核酸的方法和免疫學方法(You等人,Q^reW 7b/ /w / K/ro/ogy 4:63-73 (2004》 以及 Lightner 等人,匈wacw/ we 164(1):201-220 (1998))。聚合酶鏈反應(PCR)方法因其簡單、快速和靈 敏而備受關注。基于擴增基因組不同診斷區域檢測WSSV的PCR方法 已有描述(見例如Kou等人,美國專利號6,190,862; Lee,美國專利號 6,872,532; Hameed等人,匈匿w&群她歷畫/ 13(5):441-450 (2005); Jian等人,Z)/oses q/勿wac Ogam'扁s 67(1&2): 171-176 (2005); 以及 Durand等人,Jo訓a/ o/f^/z Z)/,廳25(7):381-389 (2002))。另夕卜,基 于PCR的方法,具體而言為WSSV-232測定已經在泰國用于奸工業。 該測定涉及使用 ORF21中耙序歹'J的引物檢測WSSV DNA (Kiatpathomchai等人,o/F/ra/ogyA^/zo& 130:79-82 (2005))。然而,使用WSSV-232測定測試WSSV后已經發生了 WSSV感染爆發,其歸 因于靈敏度不足(Kiatpathomchai等人,同上)。顯然,需要新的及更加 靈敏的WSSV檢測測定。上述所有方法均可用于WSSV^r測;然而,這些方法通常缺乏特異 性、靈敏度,或者復雜且耗時。另外,由于病毒中的高基因突變率,針 對基因組不同區域的測試將會是有用的。因此,需要快速、準確并且易 于使用于本領域的高靈敏度的WSSV測定。通過基于WSSV基因組新 部分的引物的發現,所述問題在此得到解決。在此鑒定的引物可用于檢 測WSSV的引物指導的擴增或核酸雜交測定方法,而不具有前述方法學 相關的問題。專利技術概述在一個實施方案中,本專利技術提供了 SEQ ID N0s:l-8任一項中所述的 分離的WSSV診斷引物序列,或者與SEQ ID NOs:l-8完全互補的分離 的核酸分子。在另一個實施方案中,本專利技術提供了在此公開的一對不同的兩個 WSSV診斷引物序列,其中該對能夠引發擴增WSSV基因組內核酸區域 的核酸擴增反應。在另一個實施方案中,本專利技術提供了檢測WSSV的試劑盒,包括至 少 一對在此公開的WSSV診斷引物序列。在另一個實施方案中,本專利技術提供了檢測樣品中存在WSSV的方 法,包括(i) 提供來自懷疑含有WSSV的樣品的DNA;以及(ii) 在合適的雜交條件下用探針探測該DNA,所述探針來自SEQ IDNOs:l-8任一項的分離的WSSV診斷引物序列;其中可雜交核酸片段的鑒定證實了 WSSV的存在。 在其他實施方案中,該;險測方法鑒定未纟皮WSSV感染的DNA樣品。 在另一個實施方案中,本專利技術提供了檢測樣品中存在WSSV的方 法,包括(i) 提供來自懷疑含有WSSV的樣品的DNA;以及(ii) 用至少一對在此公開的WSSV診斷引物序列擴增DNA從而產 生擴增產物;其中擴增產物的存在證實了 wssv的存在。 在另一個實施方案中,本專利技術提供了樣品中wssv量的定量方k,包括(i) 提供來自懷疑含有WSSV的樣品的DNA;(ii) 在核酸結合熒光試劑或熒光標記的探針的存在下,用至少一對 在此公開的WSSV診斷引物序列,通過至少變性溫度和延伸溫 度之間的熱循環擴增DNA;(iii) 測量熱循環期間由核酸結合焚光試劑或熒光標記的探針產生的 熒光量;(iv) 確定核酸結合焚光分子或熒光標記的探針產生的焚光量達到基 線值以上固定閾值時的閾循環數;并且(v) 通過將測得的樣品中WSSV的閾循環數與閾循環數對模板濃度 對數的標準曲線進行比較,計算樣品中WSSV的量,所述標準 曲線使用已知濃度的標準溶液確定。附圖簡述及序列描述 本專利技術的各個實施方案可以通過下列詳述、附圖和附加序列描述而 得到更加全面的理解;所述詳述、附圖和附加序列描述形成本申請的一 部分。附圖說明圖1A顯示由WSSV病毒DNA和肌動蛋白DNA同時PCR擴增形 成的WSSV產物以及肌動蛋白內部樣品對照產物的解鏈曲線,如實施例 10所述。WSSV和肌動蛋白產物的解鏈溫度(Tm)值顯示于其對應解鏈 曲線上。圖1B顯示含有由WSSV病毒DNA和肌動蛋白DNA同時PCR擴 增形成的WSSV產物以及肌動蛋白內部樣品對照產物的樣品的瓊脂糖 凝膠電泳分離結果,如實施例10所述。WSSV和奸DNA的量顯示于各 泳道之上;M,,為100-bpDNA梯。下列序列符合37C.F.R. 1.821-1.825 (關于含有核苷酸序列和/或氨 基酸序列公開內容的專利申請的要求-序列規則)并且與世界知識產 權組織(WIPO)標準ST.25 (l8)及EPO與PCT的序列表要求(規則 5.2和49.5(a-bis)及208節以及管理說明書附件C) 一致。用于核普酸 和氨基酸序列數據的符號及格式遵守37 C.F.R. §1.822中所述規則。SEQ ID N0s:l-8是用于檢測WSSV的WSSV診斷引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs:9-12是實施例一般方法部分中所述的合成WSSV模板增產:的核苦酸序列。'.''、SEQ ID NOs:13-16是實施例10所述內部樣品對照引物的核苷酸序列。SEQIDNOs:17-19是實施例11和12所述熒光標記的探針的核苷酸 序列。專利技術詳述在此公開的是用于檢測白斑病綜合征病毒的測定中的引物。該引物 可用于有效檢測和定量強毒白斑病綜合征病毒的核酸擴增方法和雜交 測定中。在本公開內容中使用了大量術語和縮寫。提供下列定義,并應作為 權利要求和說明書的解釋的參考。 聚合酶鏈反應縮寫為PCR。 白斑病綜合征病毒縮寫為WSSV。術語分離的WSSV診斷引物序列指與診斷WSSV存在的WSSV 基因組部分對應的序列。在此所用的分離的核酸片段是單鏈或雙鏈的任選含有合成的、非 天然的或改變的核普酸堿基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式 的分離的核酸片本文檔來自技高網...

    【技術保護點】
    如SEQ ID NO:1所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQ ID NO:1完全互補的分離的核酸分子。

    【技術特征摘要】
    【國外來華專利技術】US 2006-8-24 60/839,7441. 如SEQ ID NO1所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQ IDNO1完全互補的分離的核酸分子。2. 如SEQIDNO:2所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQID NO:2完全互補的分離的核酸分子。3. 如SEQIDNO:3所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQ ID NO:3完全互補的分離的核酸分子。4. 如SEQIDNO:4所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQID NO:4完全互補的分離的核酸分子。5. 如SEQIDNO:5所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQID NO:5完全互補的分離的核酸分子。6. 如SEQIDNO:6所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQID NO:6完全互補的分離的核酸分子。7. 如SEQIDNO:7所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQID NO:7完全互補的分離的核酸分子。8. 如SEQIDNO:8所示分離的WSSV診斷引物序列,或與SEQ ID NO:8完全互補的分離的核酸分子。9. 一對兩個不同的權利要求l - 8中任一項的WSSV診斷引物序列, 其中該對能夠引發擴增WSSV基因組內核酸區域的核酸擴增反應。10. 根據權利要求9的一對兩個不同的WSSV診斷引物序列,其中 該對選自SEQIDNOs:l和2、 SEQ ID NOs:3和4、 SEQ ID NOs:5和6、 SEQ ID NOs:7和8、 SEQ ID NO:3和6、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5 的完全互補物、以及SEQIDNO:6和SEQ ID NO:4的完全互補物。11. 檢測WSSV的試劑盒,所述試劑盒包括至少一對權利要求9的 WSSV診斷引物序列。12. 根據權利要求11的檢測WSSV的試劑盒,其中該試劑盒另外 包含至少一種試劑,該試劑選自熱穩定聚合酶、四種不同脫氧核苷酸三 磷酸的混合物、核酸結合熒光分子、至少一對內部樣品對照引物、至少 一個內部^t板對照和至少一對內部^t板對照引物,以及含有WSSV基因 組內核酸至少一個區域的部分的互補序列的探針,所述WSSV基因組內 核酸能夠;故至少一對WSSV診斷引物序列擴增。13. 檢測樣品中存在WSSV的方法,包括(i) 提供來自懷疑含有WSSV的樣品的DNA;以及(ii) 在合適的雜交條件下,用衍生自權利要求1-8中任一項的分 離的WSSV診斷引物序列的探針探測該DNA;其中可雜交核酸片段的鑒定證實了 WSSV的存在。14. 根據權利要求13的檢測樣品中存在WSSV的方...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:RC埃伯索爾張建中CP朗熱陳允誠
    申請(專利權)人:納幕爾杜邦公司
    類型:發明
    國別省市:US[美國]

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