衍生自ｈＢＳ細胞的心肌細胞樣細胞簇制造技術

包括心肌細胞樣細胞的簇，其中所述簇具有：ｉ）收縮細胞，ｉｉ）電連接的細胞，和表達ｉｉｉ）心臟標記包括Ｎｋｘ．２．５、肌鈣蛋白和肌球蛋白，ｉｖ）用于功能性腎上腺素能受體的標記，ｖ）用于功能性毒蕈堿受體的標記，ｖｉ）用于功能性離子通道的標記，包括ｈＥＲＧ，Ｎａ＋，Ｃａ２＋和Ｋ＋通道，ｖｉｉ）一種或多種選自ＡＦＰ，ＴＦ，ＡＰＯＡ２，ＡＨＳＧ，ＳＥＲＰＩＮＡ１，ＡＰＯＡ１，ＡＰＯＣ３，ＴＴＲ１，ＡＰＯＢ和ＲＢＰ４的內胚層標記。描述了用于制備該簇的方法和該簇在藥物發現和毒性篩選中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及新的衍生自hBS細胞的心肌細胞樣細胞簇(CMLC)，和涉及此類心肌細 胞樣細胞簇在例如藥物發現以及開發、毒性測試、細胞治療和醫療上的潛在用途。所述簇包 含表達內胚層、中胚層以及心臟標記的細胞。本專利技術還涉及所述簇的制備方法、用于治療和 毒性測試的包括一種或多種CMLC的組合物。在將所述組合物在至少-80°C的溫度下貯存至 少2年后所述組合物是穩定的，即所述簇的特性和活力在該貯存階段不實質上改變。
技術介紹
認為成熟心肌細胞為終末分化細胞，并且因而它們不具有或具有非常低的增殖能 力。人類心肌細胞可以從心臟活組織檢查分離，但是該過程是復雜的并且難以獲得活細胞 制品。此外，人類心臟組織的接近非常受限，并且因此不可能分離大量細胞。容易接近具有 人類心肌細胞表型的細胞對于開發用于心臟病的細胞治療干預是關鍵的。此外，由于缺少 供體材料以及細胞分離的某些成問題的過程，對于在臨床前藥物發現期間的體外測試當前 不能獲得人類原代心肌細胞。多潛能人類干細胞的群體可以從囊胚的內細胞團分離，并且這些細胞具有不確定 的、未分化的體外增殖的能力(Thomson et al. , 1998 ；Reubinoff et al. ,2000 ；Helns et al.，2004)。人類囊胚衍生的干(hBS)細胞的分化可以在體外自發性地出現，特別是對于 未分化細胞在次優培養條件期間(Thomson et al.，1998 ；Reubinoff et al.，2000)，此外， hBS細胞可以以沿著形成各種特化細胞類型的特定途徑的定向方式誘導(coaxed)分化，所 述特化細胞類型包括心肌細胞、內皮細胞、神經元細胞、胰島素產生β細胞和造血細胞(綜 述于Keller，Genes Dev2005)。然而，關于如何控制和操作hBS細胞分化以產生特定細胞 類型的專有群體目前已知相對少。為了從hBS細胞衍生心肌細胞，原則上已經報道兩種不同的方法。第一種為當細 胞在懸浮液中培養時通過hBS細胞的分化開始并且形成擬胚體(EBs) (Itskovitz-Eldor et al 2000,Kehat et al 2001)。在這些混合的細胞群體中，可以觀察到具有心肌細胞功能性 質的收縮區域。第二種方法基于hBS細胞與END-2細胞(內臟內胚層樣細胞系)的共培養， 其導致也顯示心肌細胞特征的細胞的搏動簇(beating cluster)的形成(Mummery et al 2003,Passier et al 2005)。所述策略的其它變化包括強迫聚集(Burridge et al 2007) 和懸滴方法(Yoon et al 2006)。基于使用的策略的變化和hBS細胞分化成心肌細胞的效 率，似乎hBS細胞系相當不同地表現，暗示使用的實際hBS細胞系可能影響最后的結果。這 樣，各細胞系可能需要用于誘導心臟發生的特定分化策略。近幾年期間，許多論文已經以各種方式描述hBS細胞衍生的心肌細胞的基本特 性。在這些報道中，細胞分析已經基于心肌細胞的分子標記的表達、結構建筑和功能性(綜 述于Ameen et al 2007 Crit RevOncol Hematol)。hBS細胞衍生心肌細胞的形態學和 超結構與成熟心肌細胞共有相似性，盡管在干細胞衍生群體中肌原纖維和肌原纖維節表 示未成熟表型(Kehat et al 2001，Snir et al 2003, Norstrom et al2006, Yoon et10al 2006)。在分子水平上，由心肌細胞表達的幾種標記還通過hBS細胞衍生心肌細胞表 達，包括轉錄因子，結構蛋白、激素、離子通道和緊密連接蛋白(Kehat et al 2001, Xu et al 2002，Mummeryet al 2003，He et al 2003，Passier et al 2005，Norstrom et al 2006，Yoon et al 2006)。總之，hBS細胞衍生心肌細胞的分子和結構性質暗示這些細胞與它們的成體對應 物(counterpart)共有相似性。然而，更重要的是所述細胞的功能性質，并且不同的藥理學 和電生理學方法已經用于檢查這些性質。衍生自hBS細胞的心肌細胞的一個主要優點在于 它們可以以培養的形式維持延長的時間而不喪失它們的自發性收縮能力。這允許相同細胞 制品的重復的非入侵性檢查。幾種研究已經證明hBS細胞衍生心肌細胞應答于α/β-腎 上腺素能_和毒蕈堿刺激，暗示所述細胞表達特定表面膜受體，所述表面膜受體與激活離 子通道、膜轉運蛋白和肌絲蛋白的信號傳導途徑偶聯(Kehat et al 2001，Xu et al 2002， Xue et al2005,Norstromet al 2006)。此外，指示結節-、心房-和心室-樣起源的 動作電位已經使用細胞內電生理學測定在hBS細胞衍生心肌細胞中鑒定(Xu et al 2002， Mummery et al 2003,He et al 2003)。總之，這些結果表示體外發育的干細胞衍生心肌細 胞具有這樣的基本功能性，其使它們對于進一步在藥物發現上的應用方面評價而言有吸引 力。作為組織樣結構，來自hBS細胞的心肌細胞樣細胞簇特別的具有用于幾種這些體 外應用的極大潛能，使它們構建用于在心肌細胞的功能屬性例如作用潛能和傳導的測定的 平臺。此外，發展的簇可以用作體外模型以研究在人類心臟發生的早期事件。此外，基于組 織相似性，所述簇可以最佳地體內用于在受傷或疾病之后的心臟功能的修復。本專利技術提出 獨特的衍生自hBS細胞的心肌細胞樣細胞簇，以用于上述的應用。
技術實現思路
本專利技術涉及新的心肌細胞樣細胞簇(CMLC)和從hBS細胞制備它們的方法。本發 明的CMLC特別良好地適合于在藥物發現和毒性測試中使用。根據本專利技術的簇包括心肌細胞樣細胞，其中所述簇具有i)收縮細胞(contracting cells),ii)電連接的細胞，和表達iii)心臟標記，包括Nkx. 2. 5、肌鈣蛋白和肌球蛋白，iv)功能性腎上腺素能受體的標記，ν)功能性毒蕈堿受體的標記，vi)功能性離子通道的標記，包括hERG，Na+, Ca2+和K+通道，vii)選自以下的一種或多種內胚層標記AFP，TF，AP0A2，AHSG，SERPINA1，APOAl， AP0C3, TTR, APOBjP RBP4。上述細胞之間的電連接可以通過間隙連接。在特定實施方式中，所述簇不表達未分化細胞的一種或多種以下標記如在實施 例 13 中描述的 0CT-3/4，SSEA-4, TRA-1-60。重要的是所述簇包含對藥理學刺激應答的細胞，所述藥理學刺激例如β -腎上腺11素能刺激(異丙基腎上腺素，腎上腺素)、α _腎上腺素能刺激(去氧腎上腺素，也可稱為 “苯腎上腺素”)、毒蕈堿刺激(卡巴膽堿、乙酰膽堿、阿托品(atropine))、鈣通道的阻斷(維 拉帕米)、hERG通道的阻斷(E4031)和起搏通道(funny channels)的抑制。根據本專利技術的簇包括心肌細胞樣細胞，并且所述簇包括上調并且具有以下特征的基因i) 500以上的表達值，ii)在心肌細胞樣細胞簇和未分化hBS細胞(FCqk)之間的基因表達上10倍以上本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于制備包括心肌細胞樣細胞的簇的方法，所述方法包括以下步驟：ｉ）使在培養基中的未分化的ｈＢＳ細胞懸浮和分離，ｉｉ）使這樣分離的聚集體進行強迫聚集，ｉｖ）在任選地包括一種或多種生長因子的培養基中使這樣強迫聚集的細胞聚集體孵育以獲得一種或多種３Ｄ結構，ｖ）將一種或多種３Ｄ結構轉移至一個或多個板并且使所述３Ｄ結構在任選地包括一種或多種生長因子的所述培養基中孵育，以使它們發育成一種或多種包括收縮細胞的簇。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P薩蒂皮，K奧克松，C阿梅恩，J辛納格倫，K達萊伯格，D斯蒂爾，
申請(專利權)人：塞拉提斯股份公司，
類型：發明
國別省市：SE[瑞典]