抗體恒定區修飾體制造技術

本發明專利技術人等成功地改善了抗體恒定區在酸性條件下的穩定性、來自鉸鏈區二硫鍵的異質性、來自Ｈ鏈Ｃ末端的異質性、在高濃度制劑中的穩定性。進一步成功地發現了在將新的Ｔ細胞表位肽的出現降至最小限度的同時降低與Ｆｃγ受體結合的新的恒定區序列。由此，成功地發現了使物性（穩定性和均一性）、免疫原性、安全性以及藥物動力學得到改善的抗體恒定區。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及物性(穩定性、異質性)、免疫原性(抗原性)、安全性和/或血漿中半 衰期得到改善的抗體恒定區和包含該恒定區的抗體。
技術介紹
抗體在血漿中(血中)的穩定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關注。其中， 有多種IgG型抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開發中(非專利文獻1、非專利 文獻2)。目前上市的抗體藥物幾乎都是IgGl亞型抗體。IgGl型抗體可以與Fc y受體結 合，可以發揮ADCC活性，認為IgGl型抗體可以作為抗癌抗體藥物。但是，在以中和抗原的 生物學作用為目的的抗體藥物中，與對Fc區的ADCC等效應子功能重要的Fc y受體的結合 有可能引發不必要的副作用，所以希望排除(非專利文獻3)。并且，有報道稱由于Fcy受 體在抗原提示細胞中表達，所以與Fcy受體結合的分子容易被抗原提示，由于蛋白或肽與 IgGl的Fc部分結合從而免疫原性增強(有可能使其增強)(非專利文獻4、專利文獻1)。 另外，認為在TGN1412的I期臨床試驗中發現的重大副作用的原因之一是抗體的Fc部分與 Fey受體的相互作用(非專利文獻5)。如上所述，從副作用和免疫原性的角度考慮，認為 在以中和抗原的生物學作用為目的的抗體藥物中不優選與Fc y受體的結合。作為雖然無法完全消除與FcY受體的結合但可以使其降低的方法，有人考慮將 IgG抗體的亞型由IgGl變為IgG2或IgG4的方法(非專利文獻6)。作為完全消除與Fcy 受體結合的方法，有人報道了向Fc區導入人工修飾的方法。例如，抗CD3抗體和抗CD4抗 體的效應子功能會引起副作用。因此，在Fc區的Fcy受體結合部分導入有野生型序列中 不存在的氨基酸突變(非專利文獻3、7)的Fcy受體非結合型的抗CD3抗體和抗CD4抗體 的臨床試驗現在正在進行(非專利文獻5、8)。另外，通過將IgGl的FcyR結合位點(EU編 號第233、234、235、236、327、330、331位)形成IgG2和IgG4的序列，可以制備Fc y受體非 結合型抗體(非專利文獻9、專利文獻2)。但這些分子中均出現能夠形成天然不存在的T 細胞表位肽的9 12個氨基酸的新的肽序列，認為存在免疫原性的風險。迄今為止，還沒 有上述課題已解決的Fcy受體非結合型抗體的報道。另一方面，在開發抗體作為藥品時，其蛋白質的物性、其中尤其是均一性和穩定性 極為重要。關于IgG2亞型，有人報道了來自鉸鏈區的二硫鍵的異質性( 卜口 7工二 f 4 一 heterogeneity)(非專利文獻10、專利文獻3)。難以在維持來源于此的目標物質/相關 物質的異質性的批次間差異(製造間差)的同時作為藥品進行大量制造。優選作為藥物開 發的抗體分子盡可能是單一物質。另外，IgG2和IgG4在酸性條件下的穩定性不足。通常IgG型抗體在使用蛋白A 的純化工序和病毒滅活工序中被暴露在酸性條件下，所以必需注意IgG2和IgG4在同樣的 工序中的穩定性，作為藥物開發的抗體分子優選在酸性條件下也穩定。在天然型的IgG2和 IgG4、以及來源于IgG2和IgG4的Fc y受體非結合型抗體(非專利文獻6、7、專利文獻2)中存在上述問題，在作為藥品開發時希望得到解決。有報道稱IgGl型抗體在酸性條件下比較穩定、來自鉸鏈區的二硫鍵的異質性也 少，但在制劑保存中，鉸鏈區的肽鍵在溶液中進行非酶性分解，生成作為雜質的Fab片段 (非專利文獻11)。在作為藥品開發時，希望解決生成雜質的問題。作為抗體C末端序列的異質性，有人報道了 由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺 失和C末端的2個氨基酸甘氨酸、賴氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(非專利文獻 12)，作為藥品開發時希望不存在上述異質性。如上所述，以中和抗原為目的的抗體藥物的恒定區優選上述所有問題均得到解決 的恒定區序列，但迄今為止還沒有關于滿足上述所有條件的恒定區的報道。關于抗體藥物的給藥方式，當在慢性自身免疫疾病等疾病的情況下，優選皮下給 藥制劑。為了能夠發揮持續的治療效果，認為通過延長抗體的血漿中半衰期來減少給藥蛋 白量、賦予高濃度制劑盡可能高的穩定性，從而可以以較長的給藥間隔進行皮下給藥，可以 提供成本低且便利性高的抗體藥物。通常皮下給藥制劑必需是高濃度制劑，相對于此，當為IgG型抗體制劑時，從穩定 性等方面考慮，通常認為100mg/mL左右的制劑是極限(非專利文獻13)，確保高濃度中的穩 定性成為課題。但迄今為止還沒有通過向恒定區中導入氨基酸取代來改善高濃度中的IgG 的穩定性的報道。作為延長抗體的血漿中半衰期的方法，有人報道了恒定區的氨基酸取代 (非專利文獻14、非專利文獻15)，但從免疫原性風險的角度考慮，并不優選向恒定區中導 入天然不存在的序列。如上所述，以中和抗原為目的的抗體藥物的恒定區優選上述所有問題均已解決的 恒定區序列，但迄今為止未見滿足上述條件的恒定區的報道。因此，人們希望開發上述問題 得到改善的抗體恒定區。需要說明的是，與本專利技術有關的在先技術文獻如下。非專利文獻 1 :Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice MReichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23，1073-1078 (2005)非專禾丨J文獻 2 :Pavlou AK, Belsey MJ. , The therapeutic antibodiesmarket to 2008.，Eur J Pharm Biopharm. 2005Apr ；59 (3) :389_96.非專利文獻3 :Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P,Dal Monte PR,Doyle ML,Brigham-Burke MR,Anderson D,Reff M,Newman R,Hanna N,Sweet Rff,Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modifiedIgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000Feb 15 ； 164 (4) 1925-33.非專利文獻 4 :Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency ofFc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol Immunother. 1997Nov-Dec ；45 (3-4) 146-8.非專禾丨J 文獻 5 Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies inrheumatology lessons learned, future directions. N本文檔來自技高網...

【技術保護點】
下述（ａ）～（ｃ）中任一項所述的人抗體恒定區：（ａ）人抗體恒定區，其特征在于：在ＳＥＱＩＤＮＯ：１記載的氨基酸序列中，第３２９位（ＥＵ編號第４４６位）的Ｇｌｙ和第３３０位（ＥＵ編號第４４７位）的Ｌｙｓ均缺失；（ｂ）人抗體恒定區，其特征在于：在ＳＥＱＩＤＮＯ：２記載的氨基酸序列中，第３２５位（ＥＵ編號第４４６位）的Ｇｌｙ和第３２６位（ＥＵ編號第４４７位）的Ｌｙｓ均缺失；（ｃ）人抗體恒定區，其特征在于：在ＳＥＱＩＤＮＯ：３記載的氨基酸序列中，第３２６位（ＥＵ編號第４４６位）的Ｇｌｙ和第３２７位（ＥＵ編號第４４７位）的Ｌｙｓ均缺失。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】JP 2007-9-26 2007-250147下述(a)～(c)中任一項所述的人抗體恒定區(a)人抗體恒定區，其特征在于在SEQ ID NO1記載的氨基酸序列中，第329位(EU編號第446位)的Gly和第330位(EU編號第447位)的Lys均缺失；(b)人抗體恒定區，其特征在于在SEQ ID NO2記載的氨基酸序列中，第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的Lys均缺失；(c)人抗體恒定區，其特征在于在SEQ ID NO3記載的氨基酸序列中，第326位(EU編號第446位)的Gly和第327位(EU編號第447位)的Lys均缺失。2.IgG2恒定區，其中，在SEQ ID NO 2記載的氨基酸序列中，第209位(EU編號第330 位)、第210位(EU編號第331位)和第218位(EU編號第339位)的氨基酸被取代成其他 氨基酸。3.IgG2恒定區，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第276位(EU編號第397 位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。4.IgG2恒定區，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第14位(EU編號第131 位)、第102位(EU編號第219位)和/或第16位(EU編號第133位)的氨基酸被取代成 其他氨基酸。5.權利要求4所述的IgG2恒定區，其特征在于在SEQID NO :2記載的氨基酸序列中， 第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第138位)的氨基酸進一步被取代成其他氨基酸。6.IgG2恒定區，其中，在SEQ ID NO :2記載的氨基酸序列中，第147位(EU編號第268 位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg和/或第298位(EU編號第419位)的 Gln被取代成其他氨基酸。7.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第209位(EU編號第330位)、第210位(EU編號第331位)、第218位(EU編號第 339位)、第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編號第 133位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第 138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。8.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在權利要求7所述的IgG2恒定 區中，進一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。9.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第276位(EU編號第397位)、第14位(EU編號第131位)、第16位(EU編號第133 位)、第102位(EU編號第219位)、第20位(EU編號第137位)和第21位(EU編號第138 位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。10.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在權利要求9所述的IgG2恒定 區中，進一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。11.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在SEQ IDNO 2記載的氨基酸序 列中，第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第102位(EU 編號第219位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg和第298 位(EU編號第419位)的Gin被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。12.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在權利要求11所述的IgG2恒定 區中，進一步缺失第325位(EU編號第446位)的Gly和第326位(EU編號第447位)的 Lys的氨基酸序列。13.IgG2恒定區，該IgG2恒定區具有下述氨基酸序列在SEQ I...

【專利技術屬性】
技術研發人員：井川智之，白巖宙丈，
申請(專利權)人：中外制藥株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]