本發明專利技術公開了一種傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝，該工藝主要包括制備免疫原，動物體內免疫，體外免疫動物淋巴細胞，制備傷寒、副傷寒特異性轉移因子等步驟。本發明專利技術口服制劑具有轉移細胞信息、介導細胞免疫反應、特異性地抑制和殺傷傷寒、副傷寒沙門菌的功能，并且能增強非特異性免疫功能；該口服制劑服用無過敏反應，使用安全，效果明顯，患者服用不會產生抗藥性；本產品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學活性，是一種安全有效的制劑，具有很好的社會價值和市場應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，特別是涉及傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝。
技術介紹
傷寒(typhiod fever)是由傷寒沙門菌引起的，人是其唯一的天然宿主及儲存者，主 要發病于學齡兒童、青壯年及旅游者，大多是通過該菌攜帶者的分泌物而污染食物和水來傳 播，發病季節高峰在7 9月。到目前為止，傷寒仍然是全球的公共衛生問題，全球均有傷寒 的報道，以熱帶、亞熱帶地區多見。隨著社會發展和公共衛生狀況的改善傷寒發病率有所下 降，但在發展中國家仍有地方性流行或局部暴發流行的趨勢。在我國貴州、廣西、云南、新 疆、江蘇等省市傷寒仍是高發區。在遵義，近20年的流行病學調査表明，傷寒的最高發病率 為10.22/10萬，且發病總體趨勢呈上升態勢，約隔5年就有一次流行高峰。副傷寒(paratyphoid fever)是由副傷寒沙門菌所致的急性傳染病，副傷寒的病原體 有3型甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌和丙型副傷寒沙門菌。甲型副傷寒是一種由 甲型副傷寒沙門菌引起的急性腸道傳染病，近年來在貴州省的發病明顯增高。據貴州省疾控 中心通報，僅2004年上半年遵義市開發區發生的副傷寒累計發病達1750例。其主要的致病因 素是革蘭氏陰性細胞壁的脂多糖(LPS)引起發熱、白細胞反應及內毒素血癥等。甲型副傷 寒沙門菌侵入機體后，主要在細胞內生長繁殖，因而要徹底殺滅這類胞內寄生菌，特異性細 胞免疫是主要的防御機制。轉移因子(transfer factor)是白細胞中有免疫活性的淋巴細胞所釋放的一種低分子 核苷酸和和多肽，其本質是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以將被某種抗原(病原) 免疫的特異性免疫反應從某一個體轉移到另一個體，非特異性的提高受者的免疫功能，促進 免疫細胞因子釋放。轉移因子包括非特異性轉移因子和特異性轉移因子。非特異性轉移因子主要用于提高人 體的免疫功能和抗病能力，而特異性轉移因子除了具備非特異性轉移因子的功能外，還可以 激發針對某種抗原的免疫反應。轉移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制轉移因子中含多肽 、核酸，在一2(TC條件下可長期保存，分子量小于5000，使用很小的劑量就可以使受體產生 局部或全身反應，作用時間快，3-4小時就可激活宿主的淋巴細胞，使受體致敏。傷寒、副傷寒特異性轉移因子能傳遞傷寒抗原特異性物質，激活T淋巴細胞、巨噬細胞 ，介導免疫反應的發生，同時提高IL-2、 IFN和集落刺激因子等多種細胞因子在體內的生成 ，作用于免疫系統的多個環節，調整多項免疫反應，以增強受體的免疫功能。傷寒、副傷寒目前主要是采用化學藥物治療，化學藥物治療導致出現了越來越多的耐藥 菌株，并且缺乏效果理想的疫苗；目前還沒有緊急預防和治療傷寒、副傷寒的生物制品。
技術實現思路
本專利技術的目的在于公開一種傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝，為傷寒 、副傷寒的緊急預防和生物治療提供一種即安全又有效的生物制劑。 本專利技術采用如下的技術方案傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝，該工藝包括如下步驟(1) 制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H9(n株、0901株和副傷寒沙門菌株 三種菌株的腦心浸液固體培養基20小時培養物，&01株20小時培養物用0.4%甲醛生理鹽水溶 解后，菌液置4。C冰箱殺菌3-5天，0901株和副傷寒沙門菌株20小時培養物分別用0. 5%石炭酸 生理鹽水溶解后，菌液置于37'C孵箱過夜殺菌；500r/m離心洗滌菌液2次，根據計算公式 細菌數OD5oo/1.25X2X 109，殺滅后的Hg(u菌株、0901菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理 鹽水配制成5億個菌/ml后，按照l: 1: l的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝 10ml/瓶，得免疫原，置于4。C冰箱保存；(2) 動物體內免疫免疫過程為第l、 3、 5、 7天背部皮下多點注射0. 5ml傷寒、副傷寒 沙門菌免疫原；第14和21天背部皮下多點注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第28天靜 脈注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結束7天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價達到 1/2000，表示免疫成功；(3) 體外免疫動物淋巴細胞無菌分離出動物脾臟淋巴細胞，用10。/。小牛血清RPMI 1640液制成5Xl(/個/ml的淋巴細胞懸液，淋巴細胞懸液、濃度為50yg/ml的PHA溶液和5X 106個/1111傷寒、副傷寒免疫原按5: 1: l的比例加入培養瓶內，置5%(]02、 37°C、飽和濕度的 細胞培養箱內培養6天，待用；(4) 制備傷寒、副傷寒特異性轉移因子取體內免疫成功動物的脾臟、淋巴結等淋巴組織加入4倍量的三蒸水絞碎勻漿后，超聲破碎細胞，采用凍結溫度為-25 5(TC、融化溫度 為20 3(TC的凍融條件凍融6次，最后將勻漿透析；(5) 體外免疫動物淋巴細胞后，收集淋巴細胞超聲破碎細胞，采用凍結溫度為-25 5CTC、融化溫度為20 30。C的凍融條件凍融6次，然后置低溫離心機以500r/min離心20min，取上清液透析；(6)收集步驟(4)和(5)中所得透析液過濾除菌，以Lorry法測定特異性轉移因子的 多肽含量，以多肽含量為lmg/ml為標準進行相應的稀釋或濃縮以多肽含量lmg/ml作為lU，按 生物制品規程分裝，每支2ml含有2單位。其中步驟(4)和(5)中所述透析條件為溫度為4'C、勻漿液和透析液比例為l:4、 IOKD透析袋、中間震蕩6次、換液一次、總透析時間不超過40小時。采用如上技術方案制得的特異性轉移因子口服制劑的主要成分是由低聚核苷酸和多肽組 成的不含蛋白的一種可溶解、可透析、可超濾的小分子物質，分子量一般在3000 5000道爾 頓。本專利技術產品具有轉移細胞信息，介導細胞免疫反應，特異性地抑制和殺傷傷寒、副傷寒 沙門菌的功能，并且能增強非特異性免疫功能，且服用無過敏反應，是輔助緊急預防和生物 治療傷寒、副傷寒的一種安全有效的生物制劑。本專利技術的制備工藝具有如下的特點1、 免疫原采用弱毒性的傷寒沙門菌H9(n株和09(n株、副傷寒沙門菌制備，免疫動物體內 產生特異性免疫應答；2、 免疫的次數、部位及劑量既可保證傷寒、副傷寒有效應答又不引起免疫耐受；3、 特定透析的條件能提高傷寒、副傷寒特異性轉移因子有效成分的含量；4、 體外免疫淋巴細胞，可節約成本，有利于控制和規范制備過程。與現有技術相比，本專利技術的產品是取材于經過傷寒、副傷寒沙門菌免疫原免疫動物后的 淋巴組織或者體外免疫淋巴細胞，采用勻漿透析法制得，具有以下優點(1) 該口服制劑具有轉移細胞信息、介導細胞免疫反應、特異性地抑制和殺傷傷寒、 副傷寒沙門菌的功能，并且能增強非特異性免疫功能；(2) 因特異性轉移因子本身沒有免疫原性，所以服用無過敏反應，使用安全，效果明 顯，患者服用不會產生抗藥性；(3) 本產品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本 身的生物學活性，是一種安全有效的制劑，具有很好的社會價值和市場應用前景。具體實施例方式本專利技術實施例按照如下步驟制備傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑 (1)制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H9(n株、0901株和副傷寒沙門菌株 三種菌株的腦心浸液固體培養基20小本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝，該工藝包括如下步驟：（１）制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原：取傷寒沙門菌Ｈ９０１株、Ｏ９０１株和副傷寒沙門菌株三種菌株的腦心浸液固體培養基２０小時培養物，Ｈ９０１株２０小時培養物用０．４％甲醛生理鹽水溶解后，菌液置４℃冰箱殺菌３－５天，Ｏ９０１株和副傷寒沙門菌株２０小時培養物分別用０．５％石炭酸生理鹽水溶解后，菌液置于３７℃孵箱過夜殺菌；５００ｒ／ｍ離心洗滌菌液２次，根據計算公式：細菌數＝ＯＤ５００／１．２５×２×１０９，殺滅后的Ｈ９０１菌株、Ｏ９０１菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理鹽水配制成５億個菌／ｍｌ后，按照１∶１∶１的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝１０ｍｌ／瓶，得免疫原，置于４℃冰箱保存；（２）動物體內免疫：免疫過程為第１、３、５、７天背部皮下多點注射０．５ｍｌ傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第１４和２１天背部皮下多點注射１．０ｍｌ傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第２８天靜脈注射１．０ｍｌ傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結束７天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價均達到１／２０００，表示免疫成功；（３）體外免疫動物淋巴細胞：無菌分離出動物脾臟淋巴細胞，用１０％小牛血清ＲＰＭＩ１６４０液制成５×１０７個／ｍｌ的淋巴細胞懸液，淋巴細胞懸液、濃度為５０μｇ／ｍｌ的ＰＨＡ溶液和５×１０６個／ｍｌ傷寒、副傷寒免疫原按５∶１∶１的比例加入培養瓶內，置５％ＣＯ２、３７℃、飽和濕度的細胞培養箱內培養６天，待用；（４）制備傷寒、副傷寒特異性轉移因子：取體內免疫成功動物的脾臟、淋巴結等淋巴組織加入４倍量的三蒸水絞碎勻漿后，超聲破碎細胞，采用凍結溫度為－２５～５０℃、融化溫度為２０～３０℃的凍融條件凍融６次，最后將勻漿透析；（５）體外免疫動物淋巴細胞后，收集淋巴細胞超聲破碎細胞，采用凍結溫度為－２５～５０℃、融化溫度為２０～３０℃的凍融條件凍融６次，然后置低溫離心機以５００ｒ／ｍｉｎ離心２０ｍｉｎ，取上清液透析；（６）收集步驟（４）和（５）中所得透析液過濾除菌，以Ｌｏｒｒｙ法測定特異性轉移因子的多肽含量，以多肽含量為１ｍｇ／ｍｌ為標準進行相應的稀釋或濃縮以多肽含量１ｍｇ／ｍｌ作為１單位，按生物制品規程分裝，每支２ｍｌ含有２單位。...
【技術特征摘要】
1.一種傷寒、副傷寒特異性轉移因子口服制劑的制備工藝，該工藝包括如下步驟(1)制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H901株、O901株和副傷寒沙門菌株三種菌株的腦心浸液固體培養基20小時培養物，H901株20小時培養物用0.4％甲醛生理鹽水溶解后，菌液置4℃冰箱殺菌3-5天，O901株和副傷寒沙門菌株20小時培養物分別用0.5％石炭酸生理鹽水溶解后，菌液置于37℃孵箱過夜殺菌；500r/m離心洗滌菌液2次，根據計算公式細菌數＝OD500/1.25×2×109，殺滅后的H901菌株、O901菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理鹽水配制成5億個菌/ml后，按照1∶1∶1的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝10ml/瓶，得免疫原，置于4℃冰箱保存；(2)動物體內免疫免疫過程為第1、3、5、7天背部皮下多點注射0.5ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第14和21天背部皮下多點注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第28天靜脈注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結束7天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價均達到1/2000，表示免疫成功；(3)體外免疫動物淋巴細胞無菌分離出動物脾臟淋巴細胞，用10％小牛血清RPMI1640液制成5×10...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫萬邦，羅軍敏，王翔，
申請(專利權)人：遵義醫學院，
類型：發明
國別省市：52[中國|貴州]
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