本發明專利技術提供了一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑主要由纖維蛋白原、凝血酶和轉ＨＧＦ基因骨髓基質干細胞組成。該生物分裝劑中的試劑是在行髓芯減壓術以雙聯注射器經減壓隧道注入兔股骨頭壞死區，纖維蛋白膠在凝血酶的作用下形成立體網狀結構凝膠作為轉ＨＧＦ基因骨髓基質干細胞的支架，并控制細胞分泌的ＨＧＦ緩慢釋放，達到防止移植的轉基因骨髓基質干細胞流失，維持ＨＧＦ局部有效的作用濃度的目的，進而促進壞死區血管再生和骨質重建。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于治療的配制品，具體涉及治療早期股骨頭缺血性壞死的醫用配制品。
技術介紹
骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)是一種由骨髓中分離獲得的具有多 種分化潛能的間質干細胞，取材方便、對機體損傷小，分離和擴增容易，同時還能分泌大量 的促細胞和血管生長因子；另外，BMSCs成分中含有骨祖細胞，具有良好的向成骨細胞分化 的潛能，在體外經地塞米松、p-甘油磷酸鈉、維生素C、骨形態發生蛋白等的誘導，可以向 成骨細胞分化；在體內主要的分化環境為骨髓及松質骨骨小梁，在局部成骨微環境下， 能夠進行增殖，并經骨原細胞、前成骨細胞最終分化為成骨細胞，被認為是骨組織工程近階 段最有希望應用于臨床的種子細胞。目前，用自體BMSCs治療早期(Ficatl、 II期)股骨頭 缺血性壞死(ANFH)已顯示出誘人的應用前景。2006年，王五洲等采用髓芯減壓加自體BMSCs 移植治療了 19例I-III期ANFH患者，術后隨訪12個月，MRI復査顯示，平均股骨頭壞死 體積由31.89%縮小至13.18%,其中I-II期改善更為明顯，患者髖關節疼痛在3周即有緩解， 肢體功能在6個月開始恢復，髖關節Harris評分由58.74升至75.54，達到良好標準，證實了 自體BMSCs治療ANFH的有效性和安全性(文獻王五洲，刑更彥，張可超，麻立剛，白曉 東，李冰.髓芯減壓并自體干細胞移植治療早期股骨頭壞死的療效觀察，中國醫師雜志，2006， 8(4):436-438)。但是，移植區低灌注、細胞成活率低是削弱其治療效果的重要因素；而且ANFH 的根本原因是血供障礙，并且病程的發展會造成進一步的血供障礙，引發ANFH的加重，是 —個惡性循環的發病過程，只有誘導新血管生成并建立新的側枝循環，才是打破治股骨頭壞 死病理惡性循環最有效的手段，單純BMSCs移植難以實現這一目標。而且ANFH骨內壓高，如果直接將轉HGF基因的BMSCs經髓芯減壓隧道植入壞死區， 細胞會隨骨內壓的釋放而流失。《骨髓間質干細胞與纖維蛋白膠生物相容性的實驗研究》 一文 公開了 BMSCs和纖維蛋白膠復合的方法(彭松林，方煌，陳安民.骨髓間質干細胞與纖維蛋 白膠生物相容性的實驗研究.生物骨科材料與臨床研究，2004.11(3): 34-37)，該方法是利用纖 維蛋白膠在凝血酶的作用下形成網狀凝膠將BMSCs包裹在內，在患者體內形成一種緩釋體 系控制BMSCs的釋放，防止細i隨骨內壓的釋放而流失。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是進一步提髙用BMSCs移植治療早期ANFH的生物治療效率。 本專利技術解決上述技術問題的技術方案是一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑由以下試劑組成-試劑I:纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為60 100mg/mL， 抑肽酶的含量為1000 3000 KIU/mL，最佳是纖維蛋白原80 mg/mL、抑肽酶2000 KIU/mL;試劑II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250~500 IU/mL， CaCl2 的含量是40 mmol/mL，最佳是凝血酶400 IU/mL;試劑m:轉基因骨髓基質干細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor, HGF)的基因。本專利技術試劑I是將纖維蛋白原和抑肽酶按配比與水混合得到:試劑II是將凝血酶和CaCl2 按配比與水混合得到。試劑m中所述的骨髓基質干細胞為同種異體骨髓基質干細胞或自體骨髓基質干細胞。所述的人肝細胞生長因子基因的結構記載于《Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for human hepatocyte growth factor》(MiyazawaJfC.， Tsubouchi，H NakaJ).， Takahashi,K., Okigaki，M Arakaki，N.， Nakayama^H Hirono，S.， Sakiyama^O Gohda3 Daikuharaj Y. and Kitamur^N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989， 163(2): 967-973)。本專利技術試劑ffl中所述的骨髓基質干細胞的制備方法由以下步驟組成(1) 利用AdMax系統，制備重組腺病毒Ad-HGF:將人HGF基因插入到穿梭質粒載體 pDC316構建穿梭質粒pDC316/HGF，將pDC316/HGF與包裝質粒pBHGloxAEl，3Cre共轉染 293細胞，得重組腺病毒Ad-HGF;(2) 擴增重組腺病毒Ad-HGF，采用HPLC色譜層析純化；(3) 髂骨穿刺抽取同種異體或自體骨髓，分離、純化BMSCs，體外培養至第二代，按 腺病毒感染復數量(MOI) =300取厶<1-110 轉染第二代8]^8€5，即可。上述方法中所述的穿梭質粒pDC316/HGF可用酶切方法鑒定將pDC316/HGF經Sac I + &/1雙酶切后將得到大小分別為2，200bp和3,913bp的片段。 所述的重組腺病毒Ad-HGF可用PCR方法鑒定引物為上游引物5'-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3' (SEQNO.l)，下 游引物5'-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3' (SEQNO.2);反應體系為取50fil 毒種上清液，加入2ia1蛋白酶K， 56C溫育，煮沸10min，冰浴冷卻，取lnl作為模板，10pM 上游引物1^1、 10fiM下游引物lpl、 10mMdNTPlnl、 2.5U/fil Taq酶1^1、 10XPCR Buffer 5 pl、 ddH2O40nl，反應體系為50nl;反應程序為95'C預變性5min，然后95°C 30s， 58'C 30s， 72 °C 2min，共30個循環，最后72'C延伸10min，擴增產物為一長2，200bp的DNA片斷。上述的轉基因骨髓基質干細胞可通過RT-PCR、原位雜交方法檢測HGF mRNA的表達、免疫組化方法檢測HGF蛋白的表達、ELISA方法檢測HGF蛋白的分泌。本專利技術生物分裝劑用于治療早期ANFH的方法是先根據不同患者對試劑在人體內形成 的凝膠的降解速度的實際需要，選擇試劑I與試劑II的按1: 1 9; l比例，然后將試劑I加入試劑ni中混合均勻，使得試劑n在體內混合后細胞終濃度為1(^個/mi，將試劑i和m混合 液與試劑n在ct引導下行髓芯減壓術時，用雙聯注射器經減壓隧道注入股骨頭壞死區。本專利技術試劑m中的轉基因骨髓基質干細胞在移植到體內后分泌HGF， HGF能誘導新血管 生成，改善股骨頭血供；HGF對BMSCs有趨化作用，局部高分泌的HGF可使BMSCs 停 留在壞死區局部，利于其向成骨細胞分化；HGF能抑制BMSCs凋亡、其誘生的血管可改 善移植細胞的生存環境，提高BMSCs移植存活率，進而提高治療效果。本專利技術試劑I和II注入體內，試劑i中的纖維蛋白原在試劑n中的凝血酶作用下快速形成立體網狀結構凝膠，所形成的凝膠結構猶如一個海綿狀的藥物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑由以下試劑組成： 試劑Ⅰ：纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為６０～１００ｍｇ／ｍＬ，抑肽酶的含量為１０００～３０００ＫＩＵ／ｍＬ； 試劑Ⅱ：凝血酶和ＣａＣｌ↓［２］的混合水溶液，其中凝血酶的含量是２５０～５００ＩＵ／ｍＬ，ＣａＣｌ↓［２］的含量是ＣａＣｌ↓［２］４０ｍｍｏｌ／ｍＬ； 試劑Ⅲ：轉基因骨髓基質干細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因；所述的骨髓基質干細胞為同種異體骨髓基質干細胞或自體骨髓基質干細胞。
【技術特征摘要】
1、一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑由以下試劑組成試劑I纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為60～100mg/mL，抑肽酶的含量為1000～3000KIU/mL；試劑II凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250～500IU/mL，CaCl2的含量是CaCl2 40mmol/mL；試劑III轉基因骨髓基質干細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因；所述的骨髓基質干細胞為同種異體骨髓基質干細胞或自體骨髓基質干細胞。2、 根...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬驪，
申請(專利權)人：南方醫科大學，
類型：發明
國別省市：81[中國|廣州]
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