本發(fā)明專利技術(shù)公開一種羅布麻總黃酮及其所含有效成分金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了羅布麻總黃酮的制備方法，其包括以下步驟，取羅布麻藥材，加乙醇提取，回收乙醇，得醇浸膏，以沸水溶解，過濾，上清液上聚酰胺柱，先用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，真空干燥得干浸膏，用比色法測定羅布麻總黃酮含量，以此干浸膏為藥用有效部位，羅布麻總黃酮含量達(dá)到５０％以上，達(dá)到國家５類中藥原料藥標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明專利技術(shù)羅布麻總黃酮藥理作用在于保肝降酶。由于本發(fā)明專利技術(shù)洗脫劑無毒性，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明專利技術(shù)為生產(chǎn)羅布麻５類原料藥提供了高效、可行，且適用于工業(yè)應(yīng)用的方法，為進(jìn)一步進(jìn)行羅布麻制劑研究打下了基礎(chǔ)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于植物藥有效部位分離、純化
，可使羅布麻有效部位總黃酮含量大于50％，達(dá)到國家5類中藥原料藥標(biāo)準(zhǔn)。羅布麻的藥理活性，文獻(xiàn)報(bào)道有保肝、降酶等藥理作用。
技術(shù)介紹
常用提取分離工藝為醇提-水沉-乙酸乙酯提取法，得總黃酮，這些方法或有效成分損失大或成分被破壞，使得總黃酮得率低，成本高。因此需要研究一種新的簡便、高效的提取分離方法，并適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于公開制備羅布麻總黃酮的方法；本專利技術(shù)的另一個目的在于公開以該成分為原料藥的藥物制劑及其保肝、降酶的用途。本專利技術(shù)目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的將干燥的羅布麻葉粉碎成粗粉，用10-30倍量的親水性溶劑加熱回流提取或冷浸滲濾提取，熱提2-3次，每次1-3小時，然后將提取液于低于60℃條件下減壓濃縮至比重1.15-1.30(70℃)的浸膏；加入原生藥量4-6倍熱水，分次溶解，靜置24小時，過濾，濾液聚酰胺為載體的柱層析，用水沖洗及用水醇比例為50∶50-5∶95的混合溶劑洗脫，收集水-醇洗脫液，于低于60℃的條件下減壓濃縮，真空干燥得羅布麻總黃酮提取物。按藥劑學(xué)方法，可以將本專利技術(shù)的羅布麻總黃酮制備成多種臨床藥物劑型作為保肝，降酶藥物，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所說的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑中的任何一種所說的非腸道給藥劑型選自于注射劑、氣霧劑、栓劑或皮下給藥劑型中的一種。附圖是羅布麻總黃酮提取工藝的流程圖。實(shí)驗(yàn)1羅布麻總黃酮的抗肝細(xì)胞炎癥作用。1材料和方法1.1材料 (1)動物昆明種小鼠♂，體重18-22g(2)藥品及試劑CCL4分析純；D-Gal分析純；羅布麻總黃酮，呈黃棕色粉末，實(shí)驗(yàn)時，以生理鹽水作溶劑配制成口服液。1.2分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為(1)正常對照組；(2)CCL4中毒組(濃度0.1％，即0.1mlCCL4溶于100ml橄欖油中，腹腔注射0.1ml·g-1)；(3)CCL4+羅布麻總黃酮200mg·kg-1；100mg·kg-1；正常對照組不中毒，只給生理鹽水溶液，給藥組均給藥7d，灌胃，與于第7d給藥后1h腹腔注射0.1％CCL4油劑0.1％ml·g-1，于第9d摘一側(cè)眼球取血，收集血清。1.3D-Gal 動物分組，觀察指標(biāo)同CCL4.中毒鼠800mg·kg-1’ip.D待中毒高峰(24h攻毒后)殺鼠取血，分別進(jìn)行生化指標(biāo)測定。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間差異t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1羅布麻總黃酮對CCL4致小鼠肝功能的影響 如表1，2，3所示中毒模型組的各項(xiàng)生化指標(biāo)與正常組比較均有明顯升高，說明小鼠肝損傷模型制作成功；給藥組分別與中毒組比較，其結(jié)果羅布麻總黃酮可明顯降低CCL4肝損傷小鼠血清中ALT水平(表1)，綜合三批動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果以100mg·kg-1組作用最為明顯，其保肝作用優(yōu)于陽性對照藥聯(lián)苯雙酯。結(jié)果表明羅布麻總黃酮可明顯降低CCL4肝損傷小鼠血清中ALT水平，對化學(xué)性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，可起到抗肝細(xì)胞炎癥的作用。表1 JS對小鼠血清生化指標(biāo)的影響(x±s，n＝79) 注與正常對照組比較，dP＜0.001；與中毒組比較gP＜0.01，fP＜0.05，，hP＜0.001，eP＞0.05. 實(shí)驗(yàn)2羅布麻總黃酮的抗乙肝病毒的作用一、材料(一)藥物羅布麻總黃酮由302醫(yī)院研制，為黃棕色粉末，實(shí)驗(yàn)時用培養(yǎng)液溶解稀釋至最大實(shí)驗(yàn)濃度4000μg/ml備用。(二)2215細(xì)胞HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(Hep G2)的2215細(xì)胞系，美國Mount sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，我國北京醫(yī)科大學(xué)傳染科引進(jìn)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒室自行傳代培養(yǎng)。(三)試劑Eagles MEM干粉，美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國Hyolone Lab公司產(chǎn)品；G-418(Genticin)，MEM配制，美國Gibco公司產(chǎn)品；L-谷氨酰胺，北科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品(400μg/100ml MEM)；HBeAg，HBsAg固相放射免疫測定盒，購自中國同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品；青霉素、鏈毒素，華北制藥廠生產(chǎn)。(四)實(shí)驗(yàn)用品及儀器培養(yǎng)瓶，丹麥Tunclon TM；培養(yǎng)板，96孔板，24孔板，美國corning公司產(chǎn)品；二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產(chǎn)品。(五)2215細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制MEM培養(yǎng)液100ml含10％胎牛血清，3％谷氨酰胺，1％G418 380μg/ml，青鏈霉素各100μg/ml，加1ml，用5％NaHCO3調(diào)pH至pH7。注試驗(yàn)用培養(yǎng)液不加G418細(xì)胞消化液，加0.25％胰酶，用Hanks液配制。二、試驗(yàn)方法(一)2215細(xì)胞培養(yǎng)在長滿2215細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，加培養(yǎng)液吹打，1∶3傳代，10天長滿，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成每毫升10萬個細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(供細(xì)胞毒性試驗(yàn))，每孔0.2ml24孔板(供藥物對病毒抗原試驗(yàn))，每孔1ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，細(xì)胞長成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(二)藥物對細(xì)胞毒性試驗(yàn)QL12000μg/ml用培養(yǎng)液2倍稀釋成6個濃度8000、4000、2000、1000、500μg/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度4孔，每4天換同濃度藥液，培養(yǎng)12天，觀察藥物對細(xì)胞的毒性，并設(shè)無藥物細(xì)胞對照。由于藥液顏色深，不能用MTT染色法觀察藥物對細(xì)胞的毒性，采用顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)為指標(biāo)。病變程度分五級完全圓化變形病變＞75％為4，病變＞50％＜75％為3，病變＞25％＜50％為2，病變＞15％＜25％為1，無病變?yōu)?。(三)結(jié)果計(jì)算計(jì)算每濃度藥液4孔平均細(xì)胞病變程度和抑制％。按Reed-Meuench法計(jì)算TC50(半數(shù)細(xì)胞毒濃度)(1)。 A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝A-B (四)藥物對HBeAg、HBsAg的抑制試驗(yàn)(2)每毫升10萬個2215細(xì)胞接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，加無毒濃度以下2倍稀釋試驗(yàn)藥液，3個稀釋度分別為4000、2000、1000、500μg/ml，每濃度3孔，37℃5％CO2培養(yǎng)，每4天收取培養(yǎng)液，換原濃度藥液培養(yǎng)，將收集的培養(yǎng)液-20℃冰凍保存將第8、12天收集的培養(yǎng)液同時測定HBeAg和HBsAg。實(shí)驗(yàn)設(shè)HBeAg、HBsAg陽性和陰性對照，細(xì)胞對照和陽性對照藥物-羧基甲酸納(Trisodium Phosphonmate，PFA)。用固相放射免疫測定盒測定，方法見說明書，用γ-計(jì)數(shù)器測定每孔藥液的放射強(qiáng)度(cpm)值。(五)藥物效果計(jì)算計(jì)算細(xì)胞對照及每濃度cmp均值及標(biāo)準(zhǔn)差，P/N值和抑制百分率(％)，半數(shù)有效濃度(IC50)及選擇指數(shù)(SI)。(3)計(jì)算藥物抑制抗原半數(shù)有效濃度(IC50) A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝A-B (5)以t檢驗(yàn)法計(jì)算各稀釋度HBeAg、HBsAg和對照組之間cpm的差別。三、試驗(yàn)結(jié)果(一)羅布麻總黃酮在2215細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性為觀察羅布麻總黃酮對乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌2215細(xì)胞的毒性，在本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種羅布麻總黃酮原料藥，其特征在于該原料藥含羅布麻總黃酮５５％～８０％。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊新波，黃正明，曹文斌，陳紅艷，楊坤，
申請(專利權(quán))人：楊新波，黃正明，曹文斌，
類型：發(fā)明
國別省市：11[中國|北京]
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