傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及從傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌培養(yǎng)液獲得的菌體中制備菌體外膜蛋白的方法以及應(yīng)該外膜蛋白制備的傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗，動物試驗表明，采用本發(fā)明專利技術(shù)的方法制備的外膜蛋白免疫試驗動物后，動物可以抵御致死劑量的同種活菌的攻擊，用本發(fā)明專利技術(shù)的方法制備的外膜蛋白組合成疫苗免疫動物或人，可以預(yù)防由傷寒、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌引起的感染。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及從傷寒沙門氏桿菌、甲型副傷寒沙門氏桿菌、乙型副傷寒沙門氏桿菌培養(yǎng)液中獲得的菌體制備菌體外膜蛋白的方法，以及用該方法制備的疫苗。
技術(shù)介紹
傷寒、副傷寒是由對人有致病力的沙門氏傷寒桿菌及甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌引起的一種全身性、急性、發(fā)熱性傳染病。主要表現(xiàn)為持續(xù)性高熱、腹痛、不適、頭痛及小腸結(jié)腸炎癥等癥狀。在成人和年長的兒童常出現(xiàn)便秘，而在幼齡兒童則常出現(xiàn)腹瀉。在患病期間大約有50-70％的病人可從糞便中分離出傷寒桿菌，甚至在恢復(fù)期糞便中仍可持續(xù)排菌，大約有2％的傷寒病人可轉(zhuǎn)為慢性攜帶者，排菌期可達(dá)1年以上。全世界每年傷寒病人數(shù)超過3300萬人，每年因傷寒而死亡的人數(shù)超過50萬人。通過改善公共衛(wèi)生條件可以降低傷寒的發(fā)病率，但是，有效的控制該病流行的最佳方式仍是預(yù)防免疫。目前傷寒、副傷寒是全世界范圍內(nèi)最主要的傳染病之一，主要高發(fā)病率地區(qū)為東南亞、非洲、南美洲等經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)的國家，特別是在印度尼西亞、越南、印度、尼日利亞等人口眾多的發(fā)展中國家，發(fā)病率高達(dá)478/10萬。沙門氏菌的不同菌株都有莢膜多糖，它具有抗吞噬作用和保護(hù)細(xì)菌避免相應(yīng)的抗體在補體參與下的溶菌作用。鑒于莢膜多糖這些與細(xì)菌侵襲力和毒力有關(guān)的特性，F(xiàn)elix和Pitt于20世紀(jì)50年代將沙門氏桿菌的莢膜多糖命名為Vi抗原，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，用粗制的Vi莢膜多糖抗原免疫小鼠后，小鼠可獲得對傷寒沙門氏菌感染的抵抗力，可保護(hù)小鼠免受再次感染。后來研究人員用乙酸處理莢膜多糖抗原，所得到的精制抗原不能使動物產(chǎn)生有效的保護(hù)力。直到20世紀(jì)80年代，研究發(fā)現(xiàn)乙酸處理抗原可導(dǎo)致Vi多糖變性，從而導(dǎo)致多糖的免疫原性發(fā)生了改變，失去了產(chǎn)生保護(hù)性抗體的可能。傷寒疫苗有注射用滅活全菌體疫苗、口服滅活全菌體疫苗、口服減毒活疫苗、注射用Vi多糖疫苗等。20世紀(jì)60-70年代，滅活全菌體疫苗在許多國家進(jìn)行了臨床研究，副反應(yīng)較大，效果不理想，已停止使用。鏈霉素依賴性傷寒突變株活疫苗在正常人體內(nèi)繁殖能力較差，免疫后效果難盡人意，且凍干型的該種疫苗又完全喪失保護(hù)力，也停止了研究。傷寒Ty21a減毒活疫苗經(jīng)過了大量臨床實驗，已被證實是目前較安全有效的傷寒疫苗之一，而且沒有嚴(yán)重的副反應(yīng)，但長期以來一些學(xué)者對Ty21a突變株提出以下仍然具有爭議的問題該減毒株的遺傳穩(wěn)定性不能確定，并推測其有毒力返祖的可能；galE基因的突變不能完全解釋該疫苗的減毒機制；有其他不明部位的基因發(fā)生了突變；凍干劑型減毒活疫苗的穩(wěn)定性不規(guī)律以及口服接種次數(shù)過多、胃腸道反應(yīng)較重等令人難以接受，目前的使用量有限。純化Vi多糖疫苗是經(jīng)使用溴化十六烷基-3-甲基銨處理的傷寒Vi多糖，具有較好的免疫原性，目前法國巴斯德-梅里厄研究所、比利時史克-必成及中國、印度的疫苗生產(chǎn)企業(yè)均已投入生產(chǎn)。在成人及2歲以上的兒童中，傷寒Vi多糖疫苗通常是經(jīng)肌肉注射或皮下深部注射免疫，一次注射后90％以上的2歲以上的被免疫者可產(chǎn)生Vi多糖抗體，血清抗體的保護(hù)性水平可維持2-3年，再次免疫時沒有回憶反應(yīng)，血清抗體水平與初次免疫相似。傷寒Vi多糖疫苗于1989-1997年間共接種了2200萬人，其中僅6人發(fā)生傷寒感染，而且有2人血培養(yǎng)結(jié)果陰性，另外2人則是3年前接種的疫苗，因此，確切判定為傷寒Vi多糖疫苗免疫失敗的只有2人。因此可以認(rèn)為傷寒Vi多糖疫苗是目前所使用的最為安全有效的傷寒疫苗。大規(guī)模人群流行病學(xué)考察結(jié)果表明傷寒Vi多糖疫苗的保護(hù)率約為70％。目前廣泛使用的傷寒Vi多糖疫苗與其他的多糖疫苗一樣，為T淋巴細(xì)胞非依賴性抗原，不能用于2歲以內(nèi)兒童的免疫，再次免疫接種時不會產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)，免疫持久性不如蛋白類的疫苗(如乙型肝炎疫苗、破傷風(fēng)疫苗等)，再次免疫時也不產(chǎn)生免疫回憶反應(yīng)。墨西哥、印度等國的科研人員自上世紀(jì)80年代開始研究傷寒外膜蛋白疫苗，研究結(jié)果顯示傷寒外膜孔蛋白A(約36KD/41KD)可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生功能性抗體，2001年墨西哥免疫學(xué)研究所開始進(jìn)行以傷寒外膜蛋白中的孔蛋白A作為后選人用傷寒疫苗的臨床研究，目前已進(jìn)行的臨床研究表明，孔蛋白A可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生殺菌抗體，且安全性良好。印度科研人員目前進(jìn)行的研究也多集中在約36KD的外膜蛋白。我國河南醫(yī)科大學(xué)/新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院的研究人員也進(jìn)行了鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白抗原的研究，研究重點也主要集中在孔蛋白的研究上，動物實驗的結(jié)果表明用外膜蛋白中36KD/41KD微孔蛋白A免疫動物后均能誘生出功能性抗體，抗體可抵抗100～500LD50劑量的鼠傷寒活菌的攻擊。以上的研究結(jié)果表明傷寒外膜蛋白抗原均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生功能性抗體，半數(shù)以上的實驗動物可抵御10～500LD50劑量的活菌的攻擊，上述各實驗中所用免疫原的劑量大多在20-100微克/只，實驗用免疫原的劑量較大，從試驗結(jié)果難以推測到人用的劑量，對人用疫苗劑量選擇的參考意義有限，且在進(jìn)行動物試驗時未選用現(xiàn)用的傷寒疫苗作為陽性對照。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了保護(hù)2歲以內(nèi)的兒童免受傷寒的侵?jǐn)_，制造一種可用于3月齡以上兒童及成人使用的傷寒/副傷寒疫苗是人群防病需要的。本專利技術(shù)即提供了一種這樣的疫苗，本專利技術(shù)將純化的傷寒/副傷寒外膜蛋白制成聯(lián)合疫苗或單獨的疫苗，疫苗成分為蛋白質(zhì)，屬T細(xì)胞依賴性抗原，動物實驗表明，該疫苗可使受試動物產(chǎn)生高效價的中和抗體，能抵御致死劑量的同種細(xì)菌的攻擊，再次加強免疫時，動物可產(chǎn)生較強的抗體回憶反應(yīng)。本專利技術(shù)所述的傷寒桿菌外膜蛋白可以用Tris-HCl緩沖液提取，也可以用含脫氧膽酸鈉、Triton-100、或Zwittergent-3-14等表面活性劑的Tris-HCl緩沖液或其他適宜的緩沖液提取。與既往文獻(xiàn)報道不同的是本專利技術(shù)在處理菌體的過程中不使用超聲波、高壓破碎機、或高速球磨機等設(shè)備的機械外力破壞菌體的細(xì)胞壁。本專利技術(shù)所使用的提取外膜蛋白的方法屬于較溫和的方法，不破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)容物也不會釋放到提取液中，所提取的外膜蛋白中基本不含核酸等雜質(zhì)的污染。本專利技術(shù)的疫苗是通過以下方法制備的步驟1、細(xì)菌培養(yǎng)；步驟2、殺菌，并收集菌體；步驟3、從菌體提取外膜蛋白；步驟4、提取液超濾，濃縮；得到外膜蛋白溶液；步驟5、以得到的外膜蛋白溶液為原料，制備成疫苗。具體可以采用以下步驟步驟1、所述細(xì)菌選自傷寒沙門氏桿菌、甲型副傷寒沙門氏桿菌、乙型副傷寒沙門氏桿菌，培養(yǎng)步驟為將細(xì)菌接種于半固體瓊脂斜面培養(yǎng)管中，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)種于含液體培養(yǎng)基的三角瓶中，待培養(yǎng)至OD650＝0.6～1.0時，轉(zhuǎn)種到全自動發(fā)酵罐中，培養(yǎng)過程中和殺菌前取樣進(jìn)行細(xì)菌濃度測定及純菌試驗，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。培養(yǎng)物于對數(shù)生長后期/靜止期前期收獲。一般培養(yǎng)8-12小時為宜(根據(jù)菌種接種量及所用培養(yǎng)基種類而異)。步驟2、加入甲醛溶液殺菌，其最終濃度為0.5-2.0％(ml/ml)。殺菌后，離心收集菌體，棄掉上清液。菌體沉淀用含磷酸鹽緩沖液的生理鹽水洗滌兩次，離心收集沉淀，得到菌體。步驟3、提取外膜蛋白采用下列方法中的任何一種均可。方法(1)用100mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，2-8℃攪拌24-72小時，離心收集上清液；方法(2)用含0.1-0.5％脫氧膽酸鈉的100mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，2-8℃攪拌24-72小時，離心收集上清液；方法本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟１、細(xì)菌培養(yǎng)；步驟２、殺菌，并收集菌體；步驟３、從菌體提取外膜蛋白；步驟４、提取液超濾，濃縮；得到外膜蛋白溶液；步驟５、以得到的外 膜蛋白溶液為原料，制備成疫苗。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1、細(xì)菌培養(yǎng)；步驟2、殺菌，并收集菌體；步驟3、從菌體提取外膜蛋白；步驟4、提取液超濾，濃縮；得到外膜蛋白溶液；步驟5、以得到的外膜蛋白溶液為原料，制備成疫苗。2.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述細(xì)菌選自傷寒沙門氏桿菌、甲型副傷寒沙門氏桿菌、乙型副傷寒沙門氏桿菌，培養(yǎng)步驟為將細(xì)菌接種于半固體瓊脂斜面培養(yǎng)管中，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)種于含液體培養(yǎng)基的三角瓶中，待培養(yǎng)至OD650＝0.6～1.0時，轉(zhuǎn)種到全自動發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)物于對數(shù)生長后期/靜止期前期收獲。3.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述殺菌是使用甲醛溶液殺菌，其最終濃度為0.5-2.0％，殺菌后，離心收集菌體，棄掉上清液，菌體沉淀用含磷酸鹽緩沖液的生理鹽水洗滌兩次，離心收集沉淀，得到菌體。4.權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述提取外膜蛋白選自下列方法中的任何一種。方法(1)用100mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，2-8℃攪拌24-72小時，離心收集上清液；方法(2)用含0.1-0.5％脫氧膽酸鈉的100mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，2-8℃攪拌24-72小時，離心收集上清液；方法(3)用含0.1-1.0％Triton的100mM Tris-HCl緩沖液重懸菌體，2-8℃攪拌24-72小時，離心收集上清液...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孔健，蔣先敏，黃穎，
申請(專利權(quán))人：北京綠竹生物制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：11[中國|北京]