本發明專利技術公開了一種促肝細胞生長蛋白質的制備工藝及其注射劑制備方法，步驟是：出生一個月內的乳牛或乳豬的肝臟用絞肉機絞碎，采用分散乳化機分散２０分鐘，加入含０．０５％的十二烷基肌氨酸鈉，破碎細胞，加熱、泠沉沉淀雜蛋白，離子交換等純化方法獲得。其中的主要有效成分２．１萬道爾頓蛋白質含量大于６０％。含量測定、藥效學和毒理學實驗結果顯示，本發明專利技術的促肝細胞生長蛋白質及其注射劑取材更方便容易，成本降低，藥理藥效與前人研究結果相當。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種生物技術藥物的制造。特別涉及促肝細胞生長素、它的制備方法和應用。
技術介紹
促肝細胞生長素是一種刺激新生的人和動物肝細胞DNA合成的藥物，該藥物可促進肝細胞再生，加速肝臟組織的修復，恢復肝功能，改善肝臟枯否細胞的吞噬功能，防止來自腸道的毒素對肝細胞的進一步損害，促進肝壞死后的修復。對肝細胞損傷有保護作用。對肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。促肝細胞生長素目前已經有產品上市，是以乳牛或乳豬的新鮮肝臟器官為原料，經過生化加工制備得到的。目前的促肝細胞生長素的制備由于大量使用動物臟器，使成本增加，同時由于工藝條件的限制，難以提高產量，生物活性不高。本專利技術采用新的工藝，提高了產率，避免了浪費，提高了生物活性，具有工業化應用價值。
技術實現思路
本專利技術提供一種促肝細胞生長素的制備方法，該方法是以出生一個月內的乳牛或乳豬的新鮮肝臟為原料，經過提取純化工藝制備而成的。本專利技術還提供用本專利技術方法制備的促肝細胞生長素，它是一種混合的蛋白質類物質，具備保肝護肝的生物效應。可以用于制備療效確切的治療肝病的藥物。本專利技術的促肝細胞生長素，優選的是促肝細胞生長素，主要活性組份蛋白質的分子量為2.1萬道爾頓。本專利技術還提供用本專利技術的促肝細胞生長素作為藥物活性成分制備的注射用藥物制劑，該藥物制劑優選的是水針劑或凍干粉針劑。作為水針劑，每2毫升含本專利技術的促肝細胞生長素活性蛋白質15～45μg；作為凍干粉針劑，每支含本專利技術的促肝細胞生長素活性蛋白質15～45μg。本專利技術的促肝細胞生長素是以出生一個月內的乳牛或乳豬的新鮮的肝臟為原料制備的，其步驟包括(1)對獲得的乳牛或乳豬的新鮮肝臟進行刺激；(2)分散乳化使細胞破碎；(3)加入溶劑并加熱；(4)冷凍沉淀雜質；(5)離心得到粗提液；(6)柱層析得洗脫液；(7)洗脫液用超濾膜超濾，純化得2～4萬道爾頓區間的藥物活性蛋白質。本專利技術的注射劑，是通過將上述本專利技術的藥物活性物質加入藥物可接受的輔料，按照制劑學常規技術進一步加工得到的。本專利技術的促肝細胞生長素藥物活性物質的制備方法具體可以經過以下步驟1、對獲得的新鮮肝臟進行刺激選取經免疫檢驗合格的出生一個月內的乳牛或乳豬，其宰殺后應立即取肝臟，并用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時進行刺激。2、分散乳化使細胞破碎。將分割放置的肝臟用絞肉機打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機乳化20分鐘，得到細膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。3、加入溶劑并加熱將分散乳化液，加入3倍體積PH 3.5的0.84％的鹽水。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達到0.05％，攪拌1小時。對上述液體加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘，4、冷凍沉淀水冷卻至室溫，轉入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。5、離心得到粗提液取上清液，用無紡布過濾，用離心機離心，得澄清的粗提液。6、柱層析將粗提液上層析柱，層析介質可以是陰離子(如陰離子大孔樹脂、DE32-纖維素、DE52-纖維素、DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose)或陽離子(如陽離子大孔樹脂、CM-纖維素、CM-Sephadex、CM-Sepharose)，然后先后用A洗液和B洗液洗脫收集洗脫液。7、洗脫液用超濾膜超濾對洗脫液，以分子量為4萬和1萬道爾頓的超濾膜超濾，經純化得到2-4萬道爾頓區間的蛋白質，并除鹽。本專利技術制備中所述的A洗液是指含氯化鈉0.20M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液；所述的B洗液是指含氯化鈉0.70M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液。本專利技術的注射劑，具體可以通過以下方法制備對上述純化的本專利技術的促肝細胞生長素藥物活性物質進行含量測定，步驟是，調整液體的PH至6.5-7.0，以福林酚法測定促肝細胞生長素藥物活性物質的含量，并調整至灌裝濃度。將調整完濃度的促肝細胞生長素溶液，過濾除菌、除熱原、加入或不加入輔料，灌裝、制成水針劑，進一步的可以經過冷凍，制成凍干粉針劑。本專利技術促肝細胞生長素能促進肝細胞DNA合成，使肝細胞再生，可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。以下通過實驗數據說明本專利技術的有益效果1、藥理作用1.1實驗性部分利用本專利技術的促肝細胞生長素，對切除大鼠肝臟后進行觀察，10天左右，可使肝臟功能恢復到原有水平；可明顯刺激單層培養的正常大鼠肝細胞DNA合成增加。1.2促肝細胞生長素的生物效應(1)能明顯刺激新生肝細胞的DNA合成，促進損傷的肝細胞線粒體、粗面內質網恢復，促進肝細胞再生，加速肝臟組織的修復，恢復肝功能。(2)改善肝臟枯否細胞的吞噬功能，防止來自腸道的毒素對肝細胞的進一步損害，抑制腫瘤壞死因子(TNF)活性和Na+，K+，-ATP酶活性抑制因子活性，從而促進肝壞死后的修復。同時具有降低轉氨酶、血清膽紅素和縮短凝血酶原時間的作用。(3)對四氯化碳誘導的肝細胞損傷有較好的保護作用。(4)對D-氨基半乳糖誘致的肝衰竭有明顯的提高存活力的作用。2、臨床應用(1)重癥肝炎中國醫科大學等單位，在綜合治療的基礎上加用促肝細胞生長素(PHGF)治療重癥肝炎1687例(對照組1196例)，兩組病死率對比PHGF組36.2％，對照組58.8％(P＜0.01)。認為促肝細胞生長素具有促進肝細胞DNA合成，促使肝細胞再生修復。降低內毒素血癥及白細胞介素6(IL 6)，白細胞介素8(IL 8)水平，減少細胞膜脂質過氧化等作用，并能抑制肝細胞壞死和炎癥反應。PHGF能抑制肝組織損傷時肝細胞Fas抗原表達，阻斷CTL細胞引起肝細胞凋亡。(2)慢性活動性肝炎上海市傳染病醫院等單位應用促肝細胞生長素治療慢性活動性肝炎1668例，對照組1084例，結果證明PHGF在降低丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)、血清膽紅素(SB)的平均復常天數均優于對照組。這與PHGF促進肝細胞再生，恢復肝功能，調節免疫有關。(3)肝硬化應用PHGF治療肝硬化34例，治療43d，結果治療組肝、脾縮小，消除腹腔積液等均優于對照組。北京地壇醫院等15家單位應用促肝細胞生長素治療肝硬化333例，對照組307例，結果促肝細胞生長素不僅具有降酶、退黃作用，而且能提高血清清蛋白和消除腹腔積液，明顯優于對照組。(4)甲胎蛋白(AFP)異常升高應用PHGF治療AFP升高48例，4周后PHGF治療組有效率82.1％，對照組62.5％，兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。(5)肝性腦病重癥肝炎血清中存在Na+K+ATP酶活性抑制因子(中分子物質)，通過抑制Na+K+ATP酶的活性，引起腦細胞功能紊亂，導致腦水腫和肝性腦病。對4例重癥肝炎治療前后Na+K+ATP酶進行測定，分別為3.047±1.624和1.444±0.250。說明用促肝細胞生長素可緩解血清中中分子物質對Na+K+ATP酶活性的抑制作用。應用促肝細胞生長素治療重癥肝炎肝性腦病的病死率53.57％，綜合治療組79.17％。提示促肝細胞生長素可降低重癥肝炎肝性腦病的病死率。(6)抗肝纖維化對28例慢性肝病患者用PHGF治療前后進行2次肝穿刺，表明促肝細胞生長素治療后肝細胞變性(胞漿疏松，氣球樣變、嗜酸性變和各種炎型的壞死)均有不同程度減輕，特別是對慢性活動性肝炎的特征改變-碎本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，經過以下步驟：（１）對獲得的乳牛或乳豬的新鮮肝臟進行刺激；（２）分散乳化使細胞破碎；（３）加入溶劑并加熱；（４）冷凍沉淀；（５）離心得到粗提液；（６）柱層析得洗脫液；（７）洗脫液用超濾膜超濾，純化得２～４萬道爾頓區間的藥物活性蛋白質。
【技術特征摘要】
1.一種促肝細胞生長素的制備方法，其特征在于，經過以下步驟(1)對獲得的乳牛或乳豬的新鮮肝臟進行刺激；(2)分散乳化使細胞破碎；(3)加入溶劑并加熱；(4)冷凍沉淀；(5)離心得到粗提液；(6)柱層析得洗脫液；(7)洗脫液用超濾膜超濾，純化得2～4萬道爾頓區間的藥物活性蛋白質。2.權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟1中所述刺激是乳牛或乳豬宰殺后應立即取肝臟，用刀立即將肝臟分割成6-8塊、4℃放置1小時。3.權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟2中所述分散乳化使細胞破碎是，將步驟1刺激后的肝臟用絞肉機打成0.5cm的小塊，然后以分散乳化機乳化20分鐘，得到細膩均勻、呈乳白色的分散乳化液。4.權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟3中所述加入溶劑并加熱是，將步驟2得到的分散乳化液加入3倍體積pH3.5的0.84％的鹽水。加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達到0.05％，攪拌1小時，對提取液加熱，至料液溫度80℃恒溫15分鐘，接著加熱至90℃恒溫20分鐘。5.權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟4中所述冷凍沉淀是用水冷卻至室溫，轉入4℃冷庫存放48小時，以沉淀油脂、雜蛋白和十二烷基肌氨酸鈉。6.權利要求1的制備方法，其特征在于，步...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭斌閣，
申請(專利權)人：郭斌閣，
類型：發明
國別省市：89[]
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