一種多肽及其衍生物與應用制造技術

本發明專利技術涉及一種多肽及其衍生物與應用。本發明專利技術公開了一種多肽疫苗的設計方式及應用。所述多肽疫苗的氨基酸分子骨架結構式為（ＡＡＮ）８（＞Ｌｙｓ）４（＞Ｌｙｓ）ｘ＞Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ；所述ＡＡＮ為病毒蛋白多肽抗原片段。本發明專利技術闡述的多肽疫苗在制備和應用過程中消除了病毒污染傳播的危險隱患，使疫苗的制備和使用更加快捷、便利、安全。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種多肽及其衍生物與應用，特別是涉及有關抗病毒多肽疫苗的設計 方式及應用，具體為抗鴨肝炎病毒多肽疫苗的設計、制備與應用。
技術介紹
鴨病毒性肝炎一年四季均可發生，其發病急、傳播迅速和死亡率高。自然爆發時僅 發生于雛鴨，發病率可高達100%，主要為3周齡以內的雛鴨，以4-8日齡最為易感；雛鴨的 死亡率則差別很大，從20%到100%，隨著雛鴨日齡的增長與機體免疫水平的提高，死亡率 逐漸降低。4周齡以后的雛鴨發病率和死亡率均很低。成年鴨呈隱性感染，無臨床癥狀且不 影響產蛋率，但能排毒。該病可通過消化道和呼吸道感染，主要的傳播途徑是與病鴨的直接 接觸感染，也可通過病鴨的糞便、食具、飲水等間接傳播。目前，對鴨病毒性肝炎病還缺少特 效藥物，因此重在預防。同時，在國內市場上還沒有獲得批準的針對鴨病毒性肝炎的有效疫 苗(包含活疫苗和滅活疫苗)，因此開發預防鴨肝炎病毒的疫苗無論從安全性和實用性均 更切合需求。傳統疫苗包括能誘發免疫力卻不致病的滅活疫苗和減毒疫苗，但由于在制備該類 疫苗時，需要足夠多的活病毒做滅活或減毒處理，在這一過程中如果操作不當將存在嚴重 的安全隱患。多肽疫苗是根據病毒蛋白或從病毒基因組編碼的蛋白中選取具有抗原表位特性 的多肽片段，通過采用化學合成技術制備出抗病毒多肽疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合 成，不存在毒力回升或滅活不全的問題，在制備和使用的過程中不存在傳播的危險，因此消 除了以往滅活疫苗或減毒疫苗存在的安全隱患。
技術實現思路
本專利技術提供了一種多肽疫苗的設計方式及其衍生物的應用，其目的是提供一種對 病毒性疾病的預防所采取的一項措施。采用病毒蛋白中具有抗原表位特性的多肽片段制備 抗病毒多肽疫苗以抵抗病毒對機體的侵害，具體到采用此設計方式制備抗鴨肝炎病毒多肽 疫苗為實例，闡述多肽疫苗的設計與應用。法氏囊是鳥類動物所特有的免疫器官，是B淋巴細胞最早發生的場所，對B細胞 的發育、成熟和遷移具有重要作用。1986年人們首次從雞法氏囊抽提液中純化出一種三肽 物質，賴氨酸-組氨酸-甘氨酰胺(Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH2)并被命名為囊素。囊 素主要是由法氏囊濾泡的上皮細胞合成和分泌。囊素不僅存在于鳥類動物的法氏囊中、胸 腺Hassall小體中、腔上囊中，而且還廣泛存在于哺乳類動物(包括人)的骨髓和肝膽上皮 細胞中，它對鳥類動物及哺乳動物的體液免疫和細胞免疫具有重要的促進作用，具有促進B 淋巴前體的分化、增殖、提高巨噬細胞的吞噬能力，顯著提高B淋巴細胞應答和免疫功能的 作用(江倩等“囊素的研究進展”，中國畜牧獸醫文摘2007年，第3期36頁)。根據獲得的鴨肝炎病毒基因組信息，根據其編碼的蛋白從中選取具有抗原表位特性的多肽片段。本專利技術采用將多拷貝病毒多肽抗原片段通過具有雙活性氨基的賴氨酸與生 物活性分子囊素相連接，使合成產物不僅克服了單一拷貝病毒多肽抗原片段分子量低，抗 原性差的缺點，同時通過囊素提升機體免疫功能，使囊素與多肽抗原產生協同作用，提高機 體對多拷貝多肽抗原的免疫應答反應。氨基酸的特點是具有一個氨基和一個羧基，比如甘氨酸(Gly，或G)的氨基與賴氨 酸(Lys，或K)的羧基經活化后進行縮合反應，使Lys與Gly形成肽鍵相連接形成Lys-Gly 合成產物。多肽固相合成的原理是將所要合成的目的多肽的羧基末端氨基酸的羧基與固 相樹脂共價連接，使該氨基酸的氨基被活化后再與所需要連接的氨基酸的活化羧基進行縮 合反應(連接上羧基末端的第二個氨基酸)，如此反復多次地進行下去。因此固相肽合成 的順序是從多肽的羧基端向氨基端逐個氨基酸地連接延伸肽鏈，待合成結束后將合成多肽 從固相樹脂上裂解下來，經過高效液相色譜分離純化后可得到高純度的多肽合成產物。由 于多肽固相合成技術目前已經非常成熟并有多肽自動化合成儀輔助，有關合成步驟和方"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis :A PracticalApproach"； W.C. Chan(Editor), Peter D. White(Editor) ；Publisher :0xfordUniversity Press, New York, USA5IEdition (March 2, 2000) 0由于多肽合成工藝穩定，因此不僅能夠高純度、大批 量地制備抗病毒多肽疫苗，而且由于疫苗的整個制備過程中杜絕了與活病毒的接觸，有效 避免了病毒的污染和擴散，使疫苗制備和應用過程中安全性得到了有效保障。本專利技術所闡述的是采用具有雙活化氨基的賴氨酸(> Lys-或> K-)作為多肽合 成底物，由于> Lys-具有兩個活化氨基，因此可以同時連接上兩個氨基酸，并往下繼續連 接氨基酸延長肽鏈，形成分支狀多肽結構，使得在生物活性片段KHG-NH2的氨基端繼續往下 延伸，將8個拷貝的病毒多肽抗原片段與囊素寡肽片段有機地連接起來，形成本專利技術所揭 示的多肽疫苗分子骨架，氨基酸序列與結構式如下；(AAn)8( > Lys)4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly，所述 AAn 為病毒多肽抗原片段，> Lys-(或> K-)代表具有雙活性氨基的賴氨酸本專利技術所提供的多肽疫苗分子骨架經在其羧基端酰胺化后得到衍生物結構如 下；(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；實例中AAn為鴨肝炎病毒蛋白多肽抗原片段Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr(15 月太)或將氨基酸序列表達為KEIAKLKHWKSYAPT。序列表達式為(KEIAKLKHWKSYAPT)8(> Lys)4( > Lys)2 > Lys-His-Gly-NH2 ；結構式如下權利要求1.一種多肽疫苗的氨基酸分子骨架結構式為(AAn)8( > Lys)4( > Lys)2 > Lys-His-Gly ；所述AAn為病毒蛋白多肽抗原片段，> Lys-代表具有雙活性氨基的賴氨酸。2.根據權利要求1所述的多肽疫苗分子骨架所產生的衍生物，其結構特征如下(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；3.根據權利要求1或2所述制備的多肽疫苗，其特征結構式如下(AAn) 8( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；所述AAn為鴨肝炎病毒蛋白多肽抗原片段，序列為KEIAKLKHWKSYAPT氨基酸序列和結構表達式為(KEIAKLKHWKSYAPT) 8 ( > Lys) 4( > Lys) 2 > Lys-His-Gly-NH2 ；4.一種多肽疫苗的衍生物，是在權利要求1至3所述的多肽氨基酸側鏈基團上、多肽 片段的氨基端或羧基端進行氨基化、酰胺化、羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸 化、酯化或糖基化所得到的衍生物。5.一種多肽衍生物，是權利要求1中所述多肽的Lys-His-Gly片段兩端所連接額外 的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種多肽疫苗的氨基酸分子骨架結構式為：（ＡＡＮ）８（＞Ｌｙｓ）４（＞Ｌｙｓ）２＞Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ；所述ＡＡＮ為病毒蛋白多肽抗原片段，＞Ｌｙｓ－代表具有雙活性氨基的賴氨酸。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓蘇，鄭杰，張慶霞，張瑜，張志剛，
申請(專利權)人：北京中天康泰生物科技有限公司，北京信得威特科技有限公司，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]