本發(fā)明專利技術公開了一種麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和再生植株的方法，其主要是根據(jù)海藻體細胞發(fā)育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜組織，游離出體細胞原生質(zhì)體，獲得再生細胞壁的體細胞和細胞系，然后將其培養(yǎng)得到再生植株。本發(fā)明專利技術利用體細胞原生質(zhì)體直接進行育苗，無須培育麒麟菜生殖成熟的藻體；體細胞原生質(zhì)體再生細胞壁轉(zhuǎn)化為體細胞，相對于有性生殖育苗技術，無須生殖細胞的有性生殖過程，縮短了育苗周期；并且苗種繁育效率高，適合于大規(guī)模育苗生產(chǎn)。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一種藻類培養(yǎng)方法，具體涉及一種麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和 再生植株的方法。
技術介紹
麒麟菜屬海藻的自然繁育主要是通過四分孢子囊和果孢子囊的方式進行繁育。目 前，在麒麟菜屬海藻養(yǎng)殖生產(chǎn)中，主要是采用切段再生的方式進行栽培養(yǎng)殖。但由于這種方 式占用水體面積大，且夏季藻體因水溫過高、降水量大導致鹽度過低等環(huán)境影響，苗種繁育 生產(chǎn)不穩(wěn)定。另外，麒麟菜屬海藻體壁具有較厚的膠質(zhì)層，無法直接應用電轉(zhuǎn)化等遺傳轉(zhuǎn)化 技術進行品種的改良。
技術實現(xiàn)思路
針對上述問題，本專利技術的目的是提供一種育苗周期短、苗種繁育效率高的麒麟菜 屬海藻的培養(yǎng)方法，它能夠解決麒麟菜屬海藻苗種保種和繁育的問題，可用于生產(chǎn)性育苗。，其主要是根據(jù)海藻體細 胞發(fā)育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜組織，游離出體細胞原生質(zhì)體，獲得再生細胞 壁的體細胞和細胞系，然后將其培養(yǎng)得到再生植株。具體步驟如下(1)利用海洋貝類提取純化制得海藻工具酶，然后加入滲透劑；(2)將麒麟菜研磨或剪切成細小的組織塊或小的分枝，浸沒在海藻工具酶溶液中消化， 獲得麒麟菜體細胞原生質(zhì)；(3)將原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生細胞壁的細胞，進一步培養(yǎng)即可得到再生植株。所述的海洋貝類為鮑。所述滲透劑為甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KC1、NaCl中的一種。所述步驟(3)中原生質(zhì)體的培養(yǎng)條件為采用PES培養(yǎng)基配成培養(yǎng)液，溫度20°C下 黑暗培養(yǎng)3-4天，轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，光照時間為12h/d，光強1500-20001X，定期更換培養(yǎng)液。本專利技術利用體細胞原生質(zhì)體直接進行育苗，無須培育麒麟菜生殖成熟的藻體；體 細胞原生質(zhì)體再生細胞壁轉(zhuǎn)化為體細胞，相對于有性生殖育苗技術，無須生殖細胞的有性 生殖過程，縮短了育苗周期；并且苗種繁育效率高，適合于大規(guī)模育苗生產(chǎn)。附圖說明圖1是麒麟菜原生質(zhì)體的熒光檢測圖(X 10倍)。圖2是麒麟菜原生質(zhì)體埃文斯藍染色結(jié)果。其中，箭頭1所示為活細胞，染色結(jié)果顯示亮黃色；箭頭2所示為死細胞，染色結(jié)果 顯示深藍色。圖3是麒麟菜原生質(zhì)體培養(yǎng)各階段圖。其中，(a)培養(yǎng)5d ； (b)培養(yǎng) 15d ； (c)培養(yǎng) 22d ； (d)培養(yǎng) 37d。圖4是培養(yǎng)22天時麒麟菜細胞的熒光檢測圖。其中，(a)為熒光檢測前；(b)為熒光檢測后。具體實施例方式下面結(jié)合附圖通過具體實施例進一步說明本專利技術。本實施例實驗材料為麒麟菜(Mucheuma den ticula turn)。1.原生質(zhì)體分離方法取1-2克麒麟菜，將其研磨或剪切成細小的組織塊或小的分枝，利用海洋貝類(鮑)消 化腺提取純化，按照生物化學純化蛋白質(zhì)(酶)的方法制成海藻工具酶，添加2 M的葡萄糖 作為滲透劑，在20-25°C下，將細小的組織塊或小的分枝浸沒在海藻工具酶溶液中2-3個小 時，期間用玻璃棒進行攪拌。用300目篩絹過濾細胞混合液，除去未消化的細胞、細胞團、碎 片；取上清液離心，SOOrpm離心lOmin，使單細胞(原生質(zhì)體)下沉，細胞碎片留在上清液中， 棄去上清液，用高滲消毒海水(分別含有l(wèi)mol/L，0. 5mol/L葡萄糖)反復沖洗、離心、棄上清 液等過程2-3次，即獲得較為純凈的麒麟菜體細胞原生質(zhì)體懸液。2.原生質(zhì)體鑒定方法采用0. 1%的熒光增白劑染色法對所得細胞進行了鑒定。首先采用0. 1%的熒光增白劑 對所得樣品進行染色5min，于熒光顯微鏡鏡下觀察，激發(fā)光波長為370nm紫外光，如圖1所 示檢測顯示為紅色。這是因為有壁細胞會有藍綠色熒光顯示纖維素存在，原生質(zhì)體無藍綠 色熒光，其由于葉綠體的存在而發(fā)紅色熒光，顯示無纖維素的存在。用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體數(shù)量，統(tǒng)計不同酶解時間下其產(chǎn)量和平均成活率，見 表1和表2。表1不同酶解時間下原生質(zhì)體產(chǎn)量權利要求1.，其特征在于它包括如下 步驟(1)利用海洋貝類提取純化制得海藻工具酶，然后加入滲透劑；(2)將麒麟菜研磨或剪切成細小的組織塊或小的分枝，浸沒在海藻工具酶溶液中消化， 獲得麒麟菜體細胞原生質(zhì)；(3)將原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生細胞壁的細胞，進一步培養(yǎng)即可得到再生植株。2.根據(jù)權利要求1所述麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和再生植株的方法，其特征 在于所述的海洋貝類為鮑。3.根據(jù)權利要求1所述麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和再生植株的方法，其特征 在于所述滲透劑為甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KC1、NaCl中的一種。4.根據(jù)權利要求1所述麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和再生植株的方法，其特征 在于所述步驟(3)中原生質(zhì)體的培養(yǎng)條件為采用PES培養(yǎng)基配成培養(yǎng)液，溫度20°C下黑暗 培養(yǎng)3-4天，轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，光照時間為12h/d，光強1500-20001x。全文摘要本專利技術公開了，其主要是根據(jù)海藻體細胞發(fā)育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜組織，游離出體細胞原生質(zhì)體，獲得再生細胞壁的體細胞和細胞系，然后將其培養(yǎng)得到再生植株。本專利技術利用體細胞原生質(zhì)體直接進行育苗，無須培育麒麟菜生殖成熟的藻體；體細胞原生質(zhì)體再生細胞壁轉(zhuǎn)化為體細胞，相對于有性生殖育苗技術，無須生殖細胞的有性生殖過程，縮短了育苗周期；并且苗種繁育效率高，適合于大規(guī)模育苗生產(chǎn)。文檔編號A01H4/00GK102144544SQ20111000349公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權日2011年1月10日專利技術者劉濤, 張偲, 金月梅 申請人:中國海洋大學本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
１． 一種麒麟菜屬海藻原生質(zhì)體分離培養(yǎng)和再生植株的方法，其特征在于它包括如下步驟：（１）利用海洋貝類提取純化制得海藻工具酶，然后加入滲透劑；（２）將麒麟菜研磨或剪切成細小的組織塊或小的分枝，浸沒在海藻工具酶溶液中消化，獲得麒麟菜體細胞原生質(zhì)；（３）將原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生細胞壁的細胞，進一步培養(yǎng)即可得到再生植株。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：劉濤，張偲，金月梅，
申請(專利權)人：中國海洋大學，
類型：發(fā)明
國別省市：95
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