CYP2E1基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種CYP2E1基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，同時涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物。方法包括：確定在人CYP2E1基因第七號外顯子的SEQ?ID?NO.1所示序列的第1009位的核苷酸；檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性；一種分離核酸，具有SEQ?ID?NO.1所示的序列，且第1009位為T；一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人CYP2E1基因的第七號外顯子的SEQ?ID?NO.1所示序列的第1009位的單核苷酸多態(tài)性的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明專利技術可用于研究我國人群中CYP2E1基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關系，為新藥研發(fā)提供指導依據(jù)。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及的是基因
的核酸及其引物和檢測方法，具體地講是一種分離 核酸、一種等位基因特異性的核酸引物和一種CYP2E1基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài) 性的檢測方法。
技術介紹
細胞色素氧化酶P450 2E1(CYP2E1)是細胞色素P450的一個成員。CYP2E1在 人類肝微粒體內(nèi)含量豐富，約占CYP450S總量的7%。人類的CYP2E1基因定位在染色體 10q26. 3。CYP2E1含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，在起始密碼子附件具有典型的TATA盒，全 長約11. 51Λ。細胞色素P4502E1是一種膜結合蛋白，分子質量為57kDa，由493個氮基酸組 成，主要結合在內(nèi)質網(wǎng)膜上。CYP2E1主要負責小分子量物質如丙酮、乙醇、乙酸等，以及亞硝 酸胺、芳香族類致癌物的代謝活化過程。此外，臨床上約有4%的常用藥物由CYP2E1催化代 謝，它常見的底物有氯唑沙宗、異煙胼、水楊酸類藥物等。多數(shù)CYP2E1的單核苷酸突變可以 影響基因的后續(xù)轉錄和表達，進而改變了酶的結構和活性，這是造成個體差異的主要原因。 鑒于CYP2E1在藥物代謝中的作用及活性存在個體差異，因此對解決CYP2E1基因多態(tài)性的 檢測和相關問題是現(xiàn)有技術急需解決的技術難題。對現(xiàn)有文獻的檢索，未發(fā)現(xiàn)有本專利技術的CYP2E1基因第七號外顯子(C1009 —T)單 核苷酸多態(tài)性(SNP)相關的報道。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種CYP2E1基因第七號外顯子 的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，同時涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物， 可用于評估個體患CYP2E1基因的第七號外顯子相關疾病的易感性，以及用于CYP2E1基因 多態(tài)性與臨床用藥安全關系的研究。本專利技術是通過以下技術方案實現(xiàn)的本專利技術涉及一種檢測人CYP2E1基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它 包括步驟(a)采用I^rimer 5. 0等相關軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP2E1基因(J02843)第七 號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物， 利用引物對來擴增CYP2E1基因的第七號外顯子的DNA序列，對擴增產(chǎn)物進行分離純化，得 到相應分離核酸。(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。采用一些分析技術可用于檢測分 離核酸的CYP2E1基因第七號外顯子的SEQ ID NO :1所示序列的第1009位核苷酸是否存在 單核苷酸多態(tài)性，即C — T的堿基突變。步驟(b)檢測多態(tài)性時采用的方法包括DNA測序法、雜交測序法；酶促錯配切割 法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、微測序法、Taqman技術、分子信標法和/或變性高效液相色譜法。本專利技術又涉及一種CYP2E1基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法的應 用，其特征在于，用于評估個體患CYP2E1基因的第七號外顯子相關疾病的易感性，用于研 究我國人群中CYP2E1基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關系，用于新藥的研究開發(fā)。本專利技術還涉及一種分離核酸，它具有SEQ ID NO :1所示的序列，且第1009位為T。本專利技術進一步涉及一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15_50bp，且特異性 地雜交并擴增出含人CYP2E1基因第七號外顯子的SEQ ID NO :1所示序列的第1009位的單 核苷酸多態(tài)性的擴增產(chǎn)物。本專利技術所述的“分離純化”是指在基因組DNA水平上，利用引物對來擴增每個多態(tài) 性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行提純。用于本專利技術的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等 樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于CYP2E1基因的第七號外顯子活性而言，可以任何含有 CYP2E1基因的第七號外顯子的樣品，如血液等。本專利技術“分離出的或純化的”是指在基因組DNA水平上，利用引物對來擴增多態(tài)性 位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行提純。通過對所取樣品CYP2E1基因測 序結果，在汕頭中發(fā)現(xiàn)了 1個樣品含有CYP2E1基因的第七號外顯子SNP (即第C1009 — T)。 本專利技術為研究我國人群中CYP2E1基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關系奠定了基礎，為藥物 設計和臨床用藥個體化提供了基因學理論根據(jù)，同時也為基于藥物基因組學理念的新藥研 發(fā)提供指導依據(jù)，具有重大的理論意義和潛在的實用價值。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施例僅用于說明本 專利技術而不用于限制本專利技術的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常照常 規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟1一種核酸的分離和測序引物設計采用Primer 5. O軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP2E1基因(NM_000773. 3)第七號外 顯子以及外顯子與內(nèi)含子接含部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，由 Invitrogen公司合成。引物信息擴增CYP2E1基因的第七號外顯子SNP位點的DNA序列引物信息正向引物5，-TGGATAAAAGCGTGATTGAATAGATGG-3，反向引物5，-CTGGAGATGCAGTATCCCACA-3，PCR擴增條件(體系各項試劑除DNA外均由Bio-Asia公司提供)反應體系總體積為15 μ 1，其中ddH20 10. Ομ 1 滅菌雙蒸水10X Buffer 1. 5 μ 1聚含反應緩沖液包含KCl Tris-HCl溶液DMSO 0. 6 μ 12mM dNTP 1. 5μ 1IOpM正反向引物各0.6μ 15U Taq 0. 3 μ 1 DNA 合成多聚酶10ng DNA 0. 5 μ 1 10ng 人體 DNA 擴增摸板PCR反應條件940C 3mins ；94°C 30seconds ；64°C 30seconds，_0· 5°C /CYCLE ；72°C Imin ； 14times to2 ；30X (94°C 30seconds ；57°C 30seconds ；72°C Imin ；)72°C 10mins。測序反應均作正反向，條件如下擴增產(chǎn)物酶純化法PCR產(chǎn)物2 μ 1加入2 μ 1純化酶系內(nèi)含SAP (Shrimp alkalin印hosphatase，堿性磷酸酶)0. 15u 和 Exo-nuclease I (核酸外切酶 1)0. 75u/ul, 37°C 30mins，85°C 20mins，4°C保存?zhèn)溆谩?貝Ij 序米用 ABI Prism BigDye terminator (BDT) cycle sequencing reaction kit (PE AppliedBiosystems)，測序總體積為5 μ 1，其中純化后的PCR產(chǎn)物4 μ 1， BDT 0. 5μ 1，正向或反向引物 0. 5μ 1。反應條件是 94°C 2mins，35X(94°C 30seconds， 55°C 40seconds,60°C 1. 5mins)，4°C保存?zhèn)溆谩Ｉ蠘忧凹兓?μ 1測序產(chǎn)物中加入25 μ 1無本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
１．一種ＣＹＰ２Ｅ１基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：（ａ）以ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫ＣＹＰ２Ｅ１基因第七號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接含部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增ＣＹＰ２Ｅ１基因的列于ＳＥＱ?。危希驳谄咛柾怙@子的ＤＮＡ序列，對擴增產(chǎn)物進行分離純化，得到相應分離核酸；（ｂ）檢測分離核酸的ＣＹＰ２Ｅ１基因第七號外顯子的ＳＥＱ　ＩＤ?。危希彼拘蛄械牡冢保埃埃刮缓塑账崾欠翊嬖趩魏塑账岫鄳B(tài)性，即１００９位Ｃ→Ｔ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：秦勝營，賀林，湯柯夫，陳培華，沈陸，
申請(專利權)人：上海交通大學，上海佰真生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：31