氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的新用途。該物質(zhì)具有較好的抗肝纖維化的作用，可明顯抑制肝星狀細(xì)胞和ＮＩＨ ３Ｔ３細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成；其能明顯降低肝纖維化大鼠血清肝纖維化標(biāo)志物水平及減輕肝纖維化組織學(xué)變化；其對(duì)肝纖維化患者有較好的降酶效果，ＡＬＴ復(fù)常率在５５．２２％～６６．６７％，肝纖維化血清標(biāo)志物及肝組織學(xué)有明顯的改善，且能夠改善肝纖維化患者的臨床癥狀；氧化苦參堿毒性低，臨床使用安全、方便。（*該技術(shù)在2020年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及氧化苦參堿的用途，尤其涉及氧化苦參堿在制藥領(lǐng)域中的用途。1979年Ibragimov等(Chem Anal 1979；9020431-9)用X-射線衍射法研究了氧化苦參堿的結(jié)構(gòu)，其分子式為C15H24N2O2，其結(jié)構(gòu)式為 該化合物可通過(guò)常規(guī)的提取方法從豆科槐植物苦參(Sophora FlavescensAit)或苦豆子(Sophora alopecuroides L.)中提取，為一種白色水溶性固體。文獻(xiàn)“中藥化學(xué)成分提取分離手冊(cè)”，中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998年8月第1版詳細(xì)報(bào)道了所述化合物的提取方法。氧化苦參堿是一種用途十分廣泛的氧化生物堿，中國(guó)專利96109782.5公開(kāi)了氧化苦參堿在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，而該化合物在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。肝纖維化是一種病理狀態(tài)，臨床醫(yī)生常將此同肝病慢性化等同起來(lái)。1984年著名肝病學(xué)家Hans Popper曾提出肝纖維性增生疾病。臨床醫(yī)生如何把這種狀態(tài)與慢性肝病區(qū)別，對(duì)診斷、治療及預(yù)后的判斷將有很大的啟發(fā)。肝纖維化是慢性肝損傷的代償性修復(fù)反應(yīng)，肝臟內(nèi)結(jié)締組織呈異常增生。生物化學(xué)測(cè)定表明，每克正常肝組織濕重平均有5.5～6.5毫克的膠原，而肝硬化的肝臟高達(dá)20毫克以上。肝纖維化是慢性肝病進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，故阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，促進(jìn)肝纖維化的逐步分解吸收，不僅能減輕肝臟損害程度，而且能防止肝硬化的發(fā)生。各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。在過(guò)去的幾十年里，肝纖維化能否發(fā)生逆轉(zhuǎn)，一直是醫(yī)學(xué)界有爭(zhēng)議的問(wèn)題，現(xiàn)已知肝纖維化是一個(gè)可逆性的病變，而肝硬化是不可逆性病變。肝纖維化的治療應(yīng)包括祛除原發(fā)病因、抗肝纖維化及對(duì)癥治療三方面。最有效的治療是病因治療。然而這在臨床上有時(shí)不易做到，且不少病例病因治療后，主動(dòng)性肝纖維化仍然繼續(xù)發(fā)展。因此抗肝纖維化治療是控制肝纖維化進(jìn)展的重要途徑。近年來(lái)人們對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制有不少的新認(rèn)識(shí)和了解，目前認(rèn)為肝纖維化形成和發(fā)展中肝星狀細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞，起中心環(huán)節(jié)作用，參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及細(xì)胞因子的調(diào)控，近來(lái)某些新干預(yù)研究已初步用于臨床。如Rockey等報(bào)道γ-干擾素是肝星狀細(xì)胞激活的強(qiáng)烈抑制劑；維甲酸也可能對(duì)肝星狀細(xì)胞激活有抑制作用；α和γ干擾素可抑制肝星狀細(xì)胞增生和基質(zhì)蛋白的合成和/或裝配；基質(zhì)金屬蛋白酶的活性受生理性抑制物如α2-巨球蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1和-2的抑制；多不飽和卵磷脂對(duì)狒狒的酒精性肝病發(fā)展為肝纖維化有明顯的保護(hù)作用；近來(lái)有人觀察到Relaxin可降低膠原合成、刺激膠原酶的表達(dá)而顯示抗肝纖維化作用；糖蛋白decorin可與TGFβ1結(jié)合，可抑制TGFβ1活性，有利于肝纖維化的改善；近年來(lái)國(guó)內(nèi)有報(bào)道中藥復(fù)方等有抗肝纖維化作用。盡管治療的藥物很多，但目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)肝纖維化有特效的藥物。因此尋找確切有效的抗肝纖維化藥物是今后努力發(fā)展的方向。本專利技術(shù)的目的在于提供氧化苦參堿的新用途，即在制藥中的新用途，根據(jù)氧化苦參堿可抑制肝星狀細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞增殖和活化的特性，提供氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。為了更好地理解本專利技術(shù)的實(shí)質(zhì)，以下將用氧化苦參堿的毒性試驗(yàn)、藥理試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。氧化苦參堿是從苦參和苦豆子中提取的白色固體，其分子式為C15H24N2O2，采用文獻(xiàn)“中藥化學(xué)成分提取分離手冊(cè)”，中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998年8月第1版報(bào)道的方法提取氧化苦參堿，純度為98％以上，余量是槐定堿。用無(wú)熱源去離子的純凈蒸餾水將氧化苦參堿溶解，消毒配制成100mg/ml/支或200mg/2ml/支的注射劑備用。具體實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果分述如下一.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.小鼠口服氧化苦參堿急性毒性實(shí)驗(yàn)昆明種小鼠一次灌胃，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，最高劑量定為443mg/kg，以0.75的比例遞減，即為443、332、249、186.9、140.2 mg/kg 5個(gè)劑量組。連續(xù)觀察14天，大劑量組(443、332mg/kg)藥后5～10分鐘活動(dòng)稍減少，20分鐘左右呈現(xiàn)雙耳發(fā)紅。各給藥組均出現(xiàn)大便濕軟，但成形。死亡發(fā)生在24小時(shí)內(nèi)，尸檢可見(jiàn)心臟淤血，其他各臟器未見(jiàn)明顯異常。存活者第15天全部解剖，肉眼檢查主要臟器未見(jiàn)明顯病變。死亡率用Bliss法求得LD50為234.55mg/kg；95％可信限為202.15～272.14mg/kg。2.氧化苦參堿小鼠肌肉注射急性毒性試驗(yàn)對(duì)昆明種小鼠肌肉注射氧化苦參堿的急性毒性進(jìn)行檢驗(yàn)，用Bliss法計(jì)算，其LD50為452.24mg/kg，95％可信限為366.77～551.35mg/kg。死亡動(dòng)物尸檢肉眼未見(jiàn)任何病變。上述結(jié)果說(shuō)明氧化苦參堿毒性非常低，臨床使用安全。二.體外實(shí)驗(yàn)一).氧化苦參堿對(duì)NIH 3T3細(xì)胞增殖的影響(一)方法1.細(xì)胞種板采用市售的NIH 3T3細(xì)胞株(該細(xì)胞的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，有公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)道，也可購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物所)，用含10％胎牛血清(上海浦東高橋獸醫(yī)站)的1640培養(yǎng)液(Giboco公司產(chǎn)品)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用0.1％胰酶消化，按1傳2進(jìn)行傳代，培養(yǎng)于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。約24小時(shí)后，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取2瓶細(xì)胞，用0.1％胰酶進(jìn)行消化，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)/ml。取4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。留下6個(gè)孔不加細(xì)胞懸液，為空白對(duì)照。將細(xì)胞板放入濕盒內(nèi)保持濕潤(rùn)并置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。2.藥物干預(yù)用含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)液將氧化苦參堿注射液稀釋成一系列濃度。氧化苦參堿稀釋為8000、6000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6(μg/ml)共11個(gè)水平；將孵育24h的96孔板取出，吸盡各孔的培養(yǎng)上清液，每孔加入100μl藥液，每個(gè)藥物水平設(shè)6個(gè)復(fù)孔。取6個(gè)孔各加入100μl含5％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，為正常對(duì)照孔。6個(gè)空白對(duì)照孔則不加任何液體。將96孔板放濕盒內(nèi)并置37℃、5％CO2溫箱中孵育。3.加MTT藥物作用48小時(shí)后加入MTT(Fluka公司產(chǎn)品)。加入MTT之前觀察藥物的毒性作用并將細(xì)胞生長(zhǎng)狀況在倒置顯微鏡拍照。MTT用PBS配成5mg/ml的濃度，每孔加入20μl MTT溶液。空白對(duì)照孔中不加MTT。繼續(xù)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。4.加入二甲基亞楓(DMSO)將作用4小時(shí)的96孔板取出，迅速吸盡每孔內(nèi)液體，棄掉。每孔各加入100μl PBS洗一次，將PBS吸盡棄掉。每孔各加入150μl DMSO溶液，包括6個(gè)空白對(duì)照孔。于搖床上搖勻作用20min后測(cè)吸光度。5.測(cè)吸光度將96孔板置酶標(biāo)儀(型號(hào)為E-Liza Mat-3000，Beckman公司產(chǎn)品)在單波長(zhǎng)570nm和雙波長(zhǎng)570nm-630nm下分別測(cè)吸光度值(OD)。各孔的吸光度值減去6個(gè)空白對(duì)照孔吸光度值的平均值即為實(shí)際的吸光度值。6.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以mean±SD表示，用SPSS軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(二)結(jié)果1.氧化苦參堿對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的毒性作用顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿濃度在8000本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王忠效，吳同新，陸倫根，何志鋒，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：31[中國(guó)|上海]