一種低溫堿性磷酸酶及其制備方法技術

本發(fā)明專利技術屬于基因工程領域，涉及一種新的堿性磷酸酶及其制備方法。本發(fā)明專利技術將如序列表ＳＥＱ　ＩＤ?。危稀。彼镜牡蜏貕A性磷酸酶的ｃＤＮＡ序列克隆到基因工程載體，表達，獲得低溫堿性磷酸酶。本發(fā)明專利技術依據大腸桿菌的密碼子偏愛理論對ＴＡＢ５低溫堿性磷酸酶的ＤＮＡ序列進行改造，使其在大腸桿菌中高表達，使用鎳親和層析和離子交換層析法對堿性磷酸酶進行純化，最終可從每升大腸桿菌菌液中得到純度在９９％以上的ＴＡＢ５堿性磷酸酶９０ｍｇ以上。本發(fā)明專利技術可應用于生命科學領域分子生物學領域的研究，特別是需要將堿性磷酸酶熱失活的多步反應，如ＤＮＡ測序前的樣品處理等。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，涉及一種DNA序列。具體而言，本專利技術涉及一種存在于 南極細菌株TAB5的堿性磷酸酶Alkaline Phosphatase (TAB5-AP)，還涉及該酶在大腸桿菌 表達系統(tǒng)中的表達和純化蛋白的方法。
技術介紹
堿性磷酸酶是廣泛存在于各種生物體中的非特異性酶，在生物體中具有重要作 用。大多數堿性磷酸酶均是一個兩個相同的亞基組成的同型二聚體，在酶的中間部分有10 組β折疊的保守序列。堿性磷酸酶作為實驗室普遍使用的一種酶，常用于在分子克隆中非 特異性地脫磷酸基團，減弱來自空載體或重組載體的環(huán)境。被磷酸酶處理過的片段缺少5’ 的磷?；鶚酥?，因此能夠避免自我環(huán)化，降低合成時環(huán)境方向性的影響。該酶可經加熱滅活 完全去除，另外作為限制酶時在所有緩沖液中都有活性，所以被廣泛應用于科學研究中。此 外，堿性磷酸酶作為一項重要的生理健康指標，在臨床醫(yī)學上有著較大的重要性。目前國內 外均有對醫(yī)學檢測堿性磷酸酶指標的研究。目前堿性磷酸酶在科學研究及臨床應用中已經起著不可替代的作用。并隨著 實驗的需要逐步被改進。一個好的堿性磷酸酶不僅能夠縮短實驗周期、化簡實驗步驟， 同時能增加基因克隆實驗的效果。該酶可經加熱滅活去除，另外作為限制酶時在所有緩 沖液中都有活性。目前研究最多、應用范圍最廣的是從蝦中提取的堿性磷酸酶Sirimp Alkaline Phosphatase.但該酶的獲取成本較高，而且容易在反應中逐漸失活。另一種 酶Calf Intestinal Alkaline Phosphotase不能熱失活，故容易引起實驗失敗，影響研 究進度。目前研究最多、應用范圍最廣的是從蝦中提取的堿性磷酸酶Shrimp Alkaline Phosphatase(SAP)。該堿性磷酸酶的DNA序列和晶體結構已經被揭示，相關蛋白質功能的 研究成果也陸續(xù)發(fā)表。SAP與外切核酸酶一起，為DNA測序或基因分型前從PCR產物中去除 核苷酸和引物提供了最簡單、最安全和最高效的方法。但該酶的獲取成本較高，而且容易在 反應中逐漸失活。另一種也廣泛使用的酶Calf Intestinal Alkaline Phosphotase (CIAP) 不能熱失活。因此需要尋找更好的酶進行替代。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有堿性磷酸酶的不足，選取已公布的、證明具有良好 失活特性的低溫堿性磷酸酶TAB5-AP，根據原核表達系統(tǒng)中的大腸桿菌密碼子偏愛理論，重 新設計了該酶的DNA序列，從而提高該酶在原核系統(tǒng)中的表達以及在純化流出中的效果。本專利技術在現有磷酸酶TAB5-AP的cDNA序列前加上了 10個組氨酸的DNA序列。組 氨酸能夠特異性的與鎳柱結合，幫助蛋白純化。根據大腸桿菌對氨基酸三聯密碼子的第三 位堿基的特定偏愛，對該氨基酸的密碼子進行同義突變，將第三位堿基替換成大腸桿菌偏 愛的堿基，修改了 TAB5-AP的原始序列。當該序列的核苷酸序列在原核系統(tǒng)中表達時，由于 大腸桿菌對替換的密碼子具有偏好，從而能夠提高蛋白的表達效率，提高目的蛋白在大腸桿菌體內的表達產量。本專利技術提供了一種低溫堿性磷酸酶的制備方法，即將如序列表SEQ ID NO 1所示 的低溫堿性磷酸酶的cDNA序列克隆到基因工程載體，表達，獲得低溫堿性磷酸酶。本專利技術對現有的低溫堿性磷酸酶TAB5-AP的DNA序列的密碼子進行了優(yōu)化，優(yōu)化 改進的內容1)依據大腸桿菌的密碼子偏好理論，對氨基酸三聯密碼子的第三位堿基進行了同 義替換。2)依據大腸桿菌存在的多密碼子偏好，同一核苷酸位點存在多個堿基替換。還可以在序列N端和(或)C端能夠根據需要接上不同的蛋白標簽。較好的，在該 酶cDNA的N端帶有10個組氨酸的DNA序列片段，以便于純化分離。組氨酸片段的長短和 在N端和(或)C端的位置能夠根據具體情況進行調整。本專利技術的低溫堿性磷酸酶的表達在室溫或低溫下進行，從而節(jié)省了能源和制備成 本。得到純化的蛋白溶液，其中蛋白純度99.0%。每升菌液得到蛋白90mg以上。具體而言，首先，合成如序列表SEQ ID NO 1所示的低溫堿性磷酸酶的cDNA序列， 即本專利技術的低溫堿性磷酸酶的核苷酸編碼序列；然后，利用基因工程方法在18 25°C誘導 表達過夜；最后，分離純化低溫堿性磷酸酶。其中，合成低溫堿性磷酸酶的核苷酸編碼序列時，可以逐個添加，也可以先合成若 干小片段，然后再將這些片段按照SEQ ID NO 1連接。其中，基因工程方法通常指，將目標DNA片段克隆到載體的多克隆位點，然后轉入 宿主復制表達。所用的的載體、宿主及相關試劑都可以采用基因工程領域常規(guī)的材料。載 體可以使用常規(guī)的pet系列載體，如質粒pET28A，宿主細胞可以采用大腸桿菌BL21，DH5 α寸。其中，分離純化的過程可以采用常規(guī)技術，也可以按照如下步驟進行1)將表達低溫堿性磷酸酶的宿主菌破菌、離心分離出蛋白；2)將步驟(1)中的上清液使用Ni-NTA親和層析柱純化，去除雜蛋白；3)將步驟( 獲得的蛋白洗脫液使用Q離子交換柱進行純化。其中，去除雜蛋白可以通過高效液相色譜技術實現?？梢匀コs蛋白后的蛋白洗脫液用透析法對蛋白溶液進行置換。也可以將所得蛋 白洗脫液使用Q離子交換柱進一步純化。本專利技術還包括對分離純化后的低溫堿性磷酸酶的蛋白溶液進行濃縮。所述的濃縮 可以使用本領域的常規(guī)技術，例如用超濾滲析法對蛋白溶液進行濃縮。本專利技術提供了一種新型的低溫堿性磷酸酶，其核苷酸編碼序列如SEQ ID NOl所7J\ ο本專利技術還提供了含有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸編碼序列的表達載體或者克隆 載體。本專利技術的制備方法得到的純化的低溫堿性磷酸酶蛋白溶液，其中蛋白純度通常在 92%以上，較好的能夠達到95%，甚至99.0%以上，每升菌液得到蛋白90mg以上。為了克服現有堿性磷酸酶的不足，本專利技術選取已公布的、證明具有良好失活特性 的低溫堿性磷酸酶TAB5-AP，根據原核表達系統(tǒng)中的大腸桿菌密碼子偏愛理論，重新設計了該酶的DNA序列，從而提高該酶在原核系統(tǒng)中的表達以及在純化流出中的效果。得到純化 的蛋白溶液，其中蛋白純度99.0%。每升菌液得到蛋白90mg以上。本專利技術的低溫堿性磷酸 酶的制備方法，操作簡便，節(jié)能高效，對生產條件和設備要求都較低。本專利技術可廣泛應用于 生命科學領域分子生物學領域的研究，特別是需要將堿性磷酸酶熱失活的多步反應，如DNA 測序前的樣品處理等。本專利技術為工具酶的生產提供一種新方法和新思路，使得其能夠應用于商業(yè)生產和 科學研究中。本專利技術的有益效果是大大提高了該低溫堿性磷酸酶在原核表達系統(tǒng)中的產 量，對該酶的商業(yè)化生前景有決定性意義。具體實施例方式使用聚合酶鏈式反應polymerase chain reaction(PCR)法對TAB5-AP序列進 行擴增，用限制性內切酶對該片段和載體質粒進行消化，再將片段接入載體中，構建帶有 TAB5-AP片段的質粒。最后轉入到大腸桿菌感受態(tài)中進行正篩選。挑陽性單克隆后在含有l(wèi)OOug/ml氨芐霉素的5ml LB培養(yǎng)液中活化過夜，隨后轉 至IL自動誘導培養(yǎng)基中，先于37°C培養(yǎng)4至5個小時，待細菌大量生長后置于20°C低溫誘 導表達15個小時。誘導表達后在5，OOOg轉速離心20分鐘收集細菌。用洗脫N本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種低溫堿性磷酸酶，其特征在于，其核苷酸編碼序列如ＳＥＱ　ＩＤ?。危稀。彼?。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：丁澦，陸致晟，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發(fā)明
國別省市：31[中國|上海]