新型肽酶底物制造技術

本發明專利技術涉及具有下式(I)的用于檢測微生物中肽酶活性的酶底物，其中：□X為S、NX1、O或NX1-CO；□R1不存在或者為如下取代基之一：Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；□R2不存在或為如下取代基之一：Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亞乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2-CO2Hα；□X1選自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基；□R3和R4獨立地為H或者含有1-4個碳原子的烷基；P為肽；?

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】新型肽酶底物本專利技術涉及用于檢測肽酶活性的新型酶底物。這些底物可用于包括產生物理化 學信號的酶水解步驟的應用，尤其用于微生物學、生物化學、免疫學、分子生物學、組 織學等中。本專利技術還涉及含有該底物的反應介質、該底物或該介質在檢測肽酶活性和/ 或區分革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌中的用途、以及使用方法。當前存在非常多的檢測微生物的介質。該檢測可以尤其基于使用特別的底物， 所述底物對需要檢測的微生物酶具有特異性。通常而言，合成的酶底物由對待發現的酶 活性具有特異性的第一部分和用作標簽(通常為發色或熒光標記)的第二部分。因此， 在細菌的情況下，取決于是否有反應來選擇底物，可以表征微生物的性質。肽酶活性可 以尤其用于發現一組、一種或一類細菌。因此，例如丙胺酸氨基肽酶可以區分革蘭氏陰 性菌和革蘭氏陽性菌。用于檢測肽酶活性的發色的酶底物由現有技術已知。尤其可以提及Manafi發 表的論文(Manafi等，Microbiol Rev 55 (3) 335-348，1991)，這是一篇關于用于微生物 學的酶底物的綜述。然而，所述的氨基肽酶底物通過水解會釋放在介質中擴散的化合物 (β “萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。結果導致在多相反應介質(培養皿上的菌落、 組織部分等)中，無法準確定位水解的位置。還可以提及在由本申請人提交的專利申請 \^0 98/04735和\^099/38995中描述的底物。然而，雖然這些底物不在培養介質中大量 擴散，但是它們也具有一些缺點它們難以合成，純度低，產率低且它們對某些微生物 有毒。為此，本專利技術提出了用于檢測微生物的新型肽酶底物。與現有的底物相比，這 些新型的底物易于合成，且由于其形成一種不在反應介質中擴散的顏色而可以尤其用于 膠體介質中以檢測微生物。由此，可以從不顯示肽酶活性的菌落或細胞器中，辨別顯示 肽酶活性的菌落或細胞器。在對本專利技術進行描述之前，給出如下定義以方便本專利技術的公開。術語“酶底物”用于指可以通過酶進行水解以形成產物，從而允許微生物細胞 或細胞器的直接或間接檢測的底物。該底物尤其包含對待發現的酶活性具有特異性的第 一部分和用作標簽的第二部分。本專利技術的底物尤其適用于流式細胞術，這是因為水解產物主要保留在表達酶活 性的細胞中，所以可以具體數出表達該活性的細胞或者甚至將其與其他樣品分開。本專利技術的底物還高度適用于組織酶學，這是因為水解產物主要保留在水解點 上，所以可以具體識別出在組織中表達該活性的細胞或細胞器。由于其具有低毒性，本專利技術的底物高度適于監測細胞培養肽酶的活性。本專利技術的底物還非常適合用于檢測和/或識別介質中，這是因為它們形成在反 應介質中不擴散的顏色或熒光。在本申請中，術語“顏色”用于指顏色，其吸收可見光 譜中的光或熒光，其在一個波長(Aat)吸收且在較高的波長(λ_，Aem> λ J發光。本專利技術的底物可以成鹽，即呈諸如為氯化物、溴化物、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽 的形式。術語“Μ”用于指能夠通過水解而斷裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在肽 酶的酰基殘基和伯胺之間形成。術語“氨某flt_”用于指能夠通過水解而斷裂出酰胺基 的酶，其中所述酰胺基在氨基酸酰基和伯胺之間形成。在本申請中，術語“肽酶”在適 當情況下可以指上述的肽酶以及氨基肽酶。術語“肽”用于指包含1-10個氨基酸，優選1-4個氨基酸的肽鍵鏈。優選， 所述肽為二-丙胺酸或三-丙胺酸。術語“氨基酸”用于指任何為本領域技術人員熟知 的天然或非天然氨基酸。根據本專利技術的一個具體實施方案，氨基酸為丙胺酸或L-丙 胺酸，或者為甘氨酸、焦谷氨酰等。所述肽可以包含在其N末端上的封端劑。本專利技術的封端劑包含任何為本領域技 術人員已知的能夠保護胺的封端劑。例如可以提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)、9-芴基氧 羰基、助溶劑如琥珀酰，或者不可代謝的氨基酸，即非天然的氨基酸如哌可酸,或者氨 基酸的D形式如D-苯基丙胺酸。所述封端劑并不系統地存在于本專利技術的化合物中。術語“烷基”用于指基于飽和烴基團的鏈,尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6個 碳原子的直鏈或支鏈烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、 戊基、異戊基及己基。術語“M”用于指由芳環衍生的官能團(或取代基)，例如C6-Cltl芳環，尤 其為苯基、芐基、1-萘基或2-萘基。術語“遨基”尤其指由經由一個雙鍵而與第一個氧原子連接且經由一個單鍵而 與第二個氧原子相連的碳原子組成的官能團，其中所述第二個氧原子為電負性或者與氫 原子相連接。取決于分子的pKa以及介質的pH，所述羧基可以呈離子化的形式，即第二 個氧原子未連接H，則其為電負性。術語“反應介質”用于指包含表達細胞或細胞器的新陳代謝和/或微生物生長 所需的所有成分的介質。該反應介質可以用于流式細胞術、組織酶學、細胞培養等，或 者用作微生物檢測和/或識別介質。所述反應介質可以包含一種成分或多種組合成分，例如氨基酸類、蛋白胨、 烴、核苷酸、礦物質、維生素、抗體、表面活性劑、緩沖溶液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽或 金屬鹽類。所述介質還可以包含著色劑。例如作為著色劑可以提及伊文思藍、中性紅、羊 血、馬血、遮光劑例如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠等。所述反應介質可以為固體、半固體或液體。術語“固體介質”用于例如指凝膠 化的介質。瓊脂在微生物學中為用于培養微生物的常規凝膠劑，但是可以使用明膠或瓊 脂糖。有些制品是可商購獲得的，例如哥倫比亞瓊脂、胰酪蛋白胨大豆瓊脂、麥康基瓊 脂、沙鮑洛瓊脂，或者更通常而言描述于Microbiological Media(CRCPress)手冊中的那些。所述反應介質可以為“檢測和/或識別介質”，即顯影介質或培養及顯影介 質。在第一種情況下，在接種之前培養微生物，并且在第二種情況下，檢測和/或識別 介質還構成培養介質。術語“牛物樣品”用于指由生物流體試樣衍生的臨床樣品，或者由任何類型食 品衍生的食品樣品。該樣品因此可以為液體或者固體，而且可以沒有限制性地提及血本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有下式（Ⅰ）的用于檢測肽酶活性的酶底物：＊＊＊其中：□Ｘ為Ｓ、ＮＸ１、Ｏ或ＮＸ１－ＣＯ；□Ｒ１不存在或者為如下取代基之一：Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨ或烷基、芳基或羧基；□Ｒ２不存在或為如下取代基之一：Ｃｌ、Ｏ－ＣＨ↓［２］－Ｏ、Ｏ－ＣＨ↓［３］、Ｆ、二亞乙基二胺－ＣＨ↓［３］、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、烷基、芳基或羧基、ＮＯ↓［２］或者＊＊＊□Ｘ１選自Ｈ、Ｃ↓［２］Ｈ↓［４］Ｐｈ、ＯＨ、烷基和芳基□Ｒ３和Ｒ４獨立地為Ｈ或者含有１－４個碳原子的烷基；Ｐ為肽。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2007.05.31 FR 07553711. 一種具有下式⑴的用于檢測肽酶活性的酶底物2.權利要求1所述的酶底物，其中 X為 O ； Rl禾口 R2不存在； P為肽。3.權利要求1所述的酶底物，其中 X為 O ； Rl 為 Cl ； R2不存在； P為肽。4.權利要求1所述的酶底物，其中 X為 S ； Rl不存在； R2不存在； P為肽。5.權利要求1所述的酶底物，其中 X為 S ； Rl不存在； R2 為 Cl ； P為肽。6.一種包含至少一種權利要求1-5中任一所述的酶底物的反應介質。7.一種包含至少一種權利要求1-5中任一所述的酶底物的微生物檢測和/或識別介質。8.權利要求7所述的檢測介質，其還包含至少一種對與通過權利要求1-5任一所述的 底物所檢測到的酶活性不同的酶活性具有特異性的其他酶底物。9.權利要求7或8所述的檢測介質，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：O·法布雷加，A·詹姆斯，V·L·薩爾瓦圖拉，S·歐倫加，S·斯坦福斯，
申請(專利權)人：生物梅里埃公司，
類型：發明
國別省市：FR