利用環化RNase H檢測基因多態性SNP位點的方法技術

一種分子生物技術領域的利用環化RNase?H檢測基因多態性SNP位點的方法，利用轉肽酶Sortase?A將線性的RNase?H環化、具有莖環結構的探針、待測DNA片段、待測DNA特異性的正向引物與反向引物、Vent?DNA聚合酶、環化的APERNase?HII，測定待測DNA片段特定位點的SNP，提高了RNase?H的熱穩定性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種分子生物
的方法，具體是一種。
技術介紹
單核苷酸多態性SNP是指在基因組上單個核苷酸的變異而導致的基因序列的多態性。SNP在基因組中分布相當廣泛，近來的研究表明在人類基因組中每300堿基對就出現一次。SNP在高危群體的發現、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究方面具有重要的應用價值。目前，已開發了多種SNP的檢測技術。但是現有SNP檢測技術或是操作過程繁瑣[BioTechniques，2009，46 :201-208]，或靈敏度差[BMC Genomics 2010,11 :641]，或需要昂貴的檢測設備[Nucleic Acides Research, 2003, Vol. 31， No. 7e37]，或檢測成本過高[BMC Genomics, 2006, 7 :291-291]。RNase H具有識別DNA與RNA雜合雙鏈中錯配堿基的特性。(1)當雜合雙鏈完全匹配時，RNase H能夠識別雜合雙鏈中的堿基并切割雜合雙鏈；( 當雜合雙鏈中含有錯配堿基時，RNase H不能識別雜合雙鏈中的堿基，不能切割雜合雙鏈。利用RNase H這一特殊的酶學特性結合PCR技術可以快速、精確地對SNP位點進行檢測。但是，線性RNase H的缺點是在PCR較高的反應溫度下往往變得不穩定甚至失活。而蛋白質環化后在生物學活性未受影響的同時其熱穩定性得到提高的報道[Rev. Biochem. 2003,72,249-289]為提高RNase H的穩定性提供了重要依據。轉肽酶Sortase A具有環化蛋白質的功能。在線性蛋白質在N端含有寡聚甘氨酸、C端含有轉肽酶Sortase A的識別序列LPXTG時，在轉肽酶Sortase A的作用下會將線性的蛋白質環化[JBC, 2009, M901752200]。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術存在的上述不足，提供一種，利用轉肽酶Sortase A將線性的RNase H環化、具有莖環結構的探針、待測DNA片段、待測DNA特異性的正向引物與反向引物、Vent DNA聚合酶、環化的APE RNase HII，測定待測DNA片段特定位點的SNP，提高了 RNase H的熱穩定性。本專利技術是通過以下技術方案實現的，本專利技術包括以下步驟步驟一、純化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有轉肽酶SortaseA識別序列的線性APE RNase HII，具體步驟包括1. 1)設計特異引物對表達載體pTWIN的多克隆位點進行突變，將酶切位點Not I 前的氨基酸序列突變為寡聚甘氨酸；突變正向引物ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGGAGGCGGCCGCAAA突變反向引物CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTCCGTTGTGTAC1. 2)設計特異引物通過PCR擴增在待環化蛋白質的C端引入轉肽酶Sortase A的識別序列LPXTG ；正向引物GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG反向引物GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAACTCGTCC1. 3)選取突變載體pTWIN中雙酶切位點Not I\Bam H I，構建含有Sortase A識別序列的蛋白質亞克隆；1. 4)利用表達的線性融合蛋白質N端含有的CBD標簽，通過幾丁質純化柱，非變性純化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有識別序列LPXTG的線性蛋白質，貯存于標準貯存緩沖液中；所述的標準貯存緩沖液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH 8. O。步驟二、環化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有識別序列的線性APE RNase HII 轉肽酶Sortase A與線性的APE RNase HII在標準反應緩沖液并溫浴Mh。所述的標準反應緩沖液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和IOmM CaCl2且口!1 8. O。所述的轉肽酶SortaseA與線性的APE RNase HII的濃度比為1 1的比例。所述的溫浴為37 °C。步驟三、鑒定環化RNase H的熱穩定性。環化的RNase H與未環化的RNase H經不同的溫度加熱處理后，鑒定其酶學活性。步驟四、合成具有莖環結構的兩端含有熒光基團及淬滅基團的探針，其結構的特征是探針5’末端及3’末端為互補序列，剩余的探針序列與待測單鏈DNA的SNP位點兩側核苷酸配對；步驟五、設計合成用于擴增目的DNA的特異性正向引物和反向引物，PCR擴增目的 DNA，正向引物GCTCCCACTCCATGAGGTATT反向引物GGGACAAGGGTCTCGGAGT所述的PCR 擴增中 PCR 反應條件為 94 C X 5min ； (94 C X 30s, 50 C X 30s, 72°C X 15s) X30循環；72°C X^iiin，擴增后的DNA片段，經膠回收純化貯存。步驟六、利用合成的探針及環化的RNase H，在乂印011印Ius儀上進行PCR反應，測定待測單鏈DNA待測位點的單核苷酸多態性，具體步驟包括6. 1)配制反應混合溶液20 μ L0將反應所需的酶環化的RNase H、Vent DNA聚合酶，底物探針、待測DNA片段，特異正向/反向引物，buffer, DEPC H2O, dNTP等混合均勻， 除氣泡。6. 2)反應溶液轉移至Mepon印Ius儀進行反應，同時檢測DNA的單核苷酸多態性。本專利技術與現有的SNP檢測技術相比，主要優勢如下(1)操作簡單方便，可以進行高通量的檢測；(2)結果快速準確，數據直觀，易于分析；(3)檢測設備簡單，不需要昂貴的檢測儀器。本專利技術可以檢測各種生物樣本的SNP。附圖說明圖1是蛋白質環化的示意圖。圖2是環化APE RNase HII的實施例示意圖。圖3是提高APE RNase HII熱穩定性的實施例示意圖。圖4是Real-time PCR檢測SNP位點的示意圖。圖5是環化APE RNase H II RNase H在檢測SNP位點中的實施例示意圖。 圖6是環化GFP蛋白的電泳實施例示意圖。圖7是環化GFP蛋白熱穩定性的實施例示意圖。 圖8是環化GFP與未環化GFP的Tm值比較分析實施例示意圖。具體實施例方式下面對本專利技術的實施例作詳細說明，本實施例在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1人類白細胞抗原(HLA)第274位核苷酸種類的鑒定本實施例中的，待測SNP位點為人類白細胞抗原HLA第274位核苷酸種類，環化的 RNaseH為APE RNase HII，實施例探針為與待測DNA匹配的C探針及錯配的U探針。第一步，純化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有轉肽酶SortaseA識別序列的線性APE RNaseHII，具體步驟包括1. 1)設計特異引物對表達載體pTWIN的多克隆位點進行突變，將酶切位點Not I 前的氨基酸序列突變為寡聚甘氨酸；1. 2)設計特異引物通過PCR擴增在待環化蛋白質的C端引入轉肽酶Sortase A的識別序列LPXTG ；1. 3)選取突變載體pTWIN中本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種利用環化ＲＮａｓｅ　Ｈ檢測基因多態性ＳＮＰ位點的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一、純化Ｎ端含有寡聚甘氨酸、Ｃ端含有轉肽酶Ｓｏｒｔａｓｅ　Ａ識別序列的線性ＡＰＥ　ＲＮａｓｅＨＩＩ；步驟二、環化Ｎ端含有寡聚甘氨酸、Ｃ端含有識別序列的線性ＡＰＥ　ＲＮａｓｅ　ＨＩＩ：轉肽酶Ｓｏｒｔａｓｅ　Ａ與線性的ＡＰＥ　ＲＮａｓｅ　ＨＩＩ在標準反應緩沖液并溫浴２４ｈ；步驟三、鑒定環化ＲＮａｓｅ　Ｈ的熱穩定性，環化的ＲＮａｓｅ　Ｈ與未環化的ＲＮａｓｅ　Ｈ經不同的溫度加熱處理后，鑒定其酶學活性；步驟四、合成具有莖環結構的兩端含有熒光基團及淬滅基團的探針，探針５’末端及３’末端為互補序列，剩余的探針序列與待測單鏈ＤＮＡ的ＳＮＰ位點兩側核苷酸配對；步驟五、設計合成用于擴增目的ＤＮＡ的特異性正向引物和反向引物，ＰＣＲ擴增目的ＤＮＡ；步驟六、利用合成的探針及環化的ＲＮａｓｅ　Ｈ，在Ｓｔｅｐｏｎｅｐｌｕｓ儀上進行ＰＣＲ反應，測定待測單鏈ＤＮＡ待測位點的單核苷酸多態性。

【技術特征摘要】
1.一種利用環化RNase H檢測基因多態性SNP位點的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、純化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有轉肽酶Sortase A識別序列的線性APE RNaseHII ；步驟二、環化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有識別序列的線性APE RNase HII 轉肽酶 Sortase A與線性的APE RNase HII在標準反應緩沖液并溫浴Mh ；步驟三、鑒定環化RNase H的熱穩定性，環化的RNase H與未環化的RNase H經不同的溫度加熱處理后，鑒定其酶學活性；步驟四、合成具有莖環結構的兩端含有熒光基團及淬滅基團的探針，探針5’末端及3’ 末端為互補序列，剩余的探針序列與待測單鏈DNA的SNP位點兩側核苷酸配對；步驟五、設計合成用于擴增目的DNA的特異性正向引物和反向引物，PCR擴增目的DNA ；步驟六、利用合成的探針及環化的RNase H，在M^on印Ius儀上進行PCR反應，測定待測單鏈DNA待測位點的單核苷酸多態性。2.根據權利要求1所述的利用環化RNaseH檢測基因多態性SNP位點的方法，其特征是，所述的第一步具體步驟包括1. 1)設計特異引物對表達載體PTWIN的多克隆位點進行突變，將酶切位點Not I前的氨基酸序列突變為寡聚甘氨酸，其中突變正向引物ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGG AGGCGGCCGCAAA突變反向引物CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTC CGTTGTGTAC1.2)設計特異引物通過PCR擴增在待環化蛋白質的C端引入轉肽酶SortaseA的識別序列LPXTG，其中正向引物GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG 反向引物GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAA CTC GTCC1.3)選取突變載體pTWIN中雙酶切位點NotI\Bam H I，構建含有Sortase A識別序列的蛋白質亞克隆；1. 4)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張琳，候敬麗，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：31