一種非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白IgA的方法技術

本發明專利技術公開了一種非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白IgA的方法。本發明專利技術所提供的提取動物免疫球蛋白的方法，包括以下步驟：將動物糞便與提取緩沖液混合，得到混合物；將所述混合物離心，取上清液，即得到所述動物中的免疫球蛋白；所述提取緩沖液由PBS緩沖液和吐溫-20組成。本發明專利技術提供了一種非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白的簡單、高效的方法。通過采集普氏野馬新鮮糞便，將新鮮糞便溶于添加有一定濃度Tween-20的提取緩沖液中，進行兩步離心取上清液，即可提取得到較高濃度的普氏野馬免疫球蛋白。此方法操作簡單且提取效率較高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及動物免疫學領域中一種非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白IgA的方法。
技術介紹
普氏野馬(Equus?przewalskii)曾廣布于歐亞大陸草原地帶，上世紀中葉野外滅絕。現存普氏野馬均為西方探險者于十九世紀末在中國和蒙古國西部捕獲并運往歐洲圈養的后代。中國于1985年從國外引回該物種并建立了繁育中心。2001年在新疆卡拉麥里自然保護區實施了普氏野馬的放歸野化。監測和評估重引入物種的生存狀態，并實施必要的人工管護，是保證放歸物種長期存活和建立野生種群的關鍵環節，但目前這些方面的工作卻開展得很少。究其原因，首先，獲取自由生活動物的組織樣本十分困難，而且定期或不定期采集研究樣本幾乎是不可能的；再者，捕捉和采集動物血液樣品本身就是一個很強的刺激因子，會嚴重干擾動物的正常生活。顯然，受到樣品獲取和測定等方面的制約，迄今尚未見放歸物種的免疫生理的研究。因此，作為監測動物機體免疫生理的重要指標，免疫球蛋白的提取和檢測對放歸物種研究尤為重要。顯然，對于監測普氏野馬免疫生理狀況，傳統的抽取血液取樣途徑已經不再適用，急需要發展一種簡單、高效、非損傷提取和檢測免疫球蛋白的方法。通常非損傷性取樣主要是采集目標動物尿液和糞便，但是普氏野馬其活動場地廣闊，且多為草地或沙質土地，排出的尿液很快就會滲入地下，不容易收集，并且腎小球濾過膜不能透過球蛋白，因此正常動物尿液中含有的免疫球蛋白很少。胃腸道黏膜固有層可以產生分泌型免疫球蛋白，進入胃腸道的膽汁中也會攜帶部分來自組織液中的免疫球蛋白。基于這些原因，與采集尿液相比，糞便途徑是一個理想的非損傷性檢測普氏野馬免疫球蛋白的方法。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種提取動物免疫球蛋白的方法。本專利技術所提供的一種提取動物免疫球蛋白的方法，包括以下步驟：將動物糞便與提取緩沖液混合，得到混合物；將所述混合物離心，取上清液，即得到所述動物免疫球蛋白；所述提取緩沖液由PBS緩沖液和吐溫-20組成。所述提取緩沖液中，所述吐溫-20的體積百分比濃度為0.01％-0.5％或0.03％-0.07％或0.03％或0.04％或0.05％或0.06％或0.07％。所述離心的方法包括以下步驟：將所述混合物進行第一步離心，取上清液，記作上清液I；將所述上清液I進行第二步離心；所述第一步離心的轉速為2000rpm、溫度為25℃和時間為20min；所述第二步離心的轉速為10000rpm、溫度為4℃或25℃和時間為10min。在將所述混合物離心前，包括將所述混合物混勻的步驟。所述混勻的方法為將所述混合物用渦旋儀在1200rpm下振蕩10min。所述PBS緩沖液由氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和水組成，各成分的濃度分別-->為氯化鈉8.5g/L、磷酸二氫鈉0.3g/L和磷酸氫二鈉2.2g/L。所述提取緩沖液的pH值為7.2。所述提取緩沖液的用量為：每1g所述動物糞便中加入10mL所述提取緩沖液。所述動物糞便為混勻后的動物糞便。所述動物為普氏野馬；所述免疫球蛋白為免疫球蛋白IgA。本專利技術提供了一種非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白的簡單、高效的方法。通過采集普氏野馬新鮮糞便，將新鮮糞便溶于添加有一定濃度Tween-20的提取緩沖液中，進行兩步離心取上清液，即可提取得到較高濃度的普氏野馬免疫球蛋白。此方法操作簡單且提取效率較高。附圖說明圖1為含有不同濃度Tween-20的提取緩沖液對普氏野馬糞便中IgA提取量的影響。圖2為魚精蛋白對普氏野馬糞便中IgA提取量的影響。圖3為不同離心溫度對糞便IgA提取量的影響。圖4為標準品孔的IgA濃度與OD值的標準曲線。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白及其檢測一、吐溫濃度對普氏野馬糞便中免疫球蛋白提取量的影響(一)非損傷性提取普氏野馬免疫球蛋白1、采集糞樣每天同一時間段觀察目標動物普氏野馬(Equus?przewalskii)(新疆普氏野馬繁育研究中心(88°45′E，44°10′N))，一旦發現其排出新鮮糞便，立即采集，分別采集雌性普氏野馬和雄性普氏野馬的糞便，采樣對象是10匹成年野馬個體(5)，連續3天采集目標個體的新鮮糞便，每天上午和下午各采集1次，將所采集的雌性普氏野馬糞便和雄性普氏野馬糞便分別裝入自封袋中并編號，及時放入-20℃條件下冷凍保存。2、配制提取緩沖液(1)配制PBS緩沖溶液稱取8.5g氯化鈉、0.3g磷酸二氫鈉和2.2g磷酸氫二鈉定容于1000ml超純水中，輕輕振蕩混勻，待溶解后，配制成pH值為7.2的PBS緩沖溶液。所述PBS緩沖溶液中氯化鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的濃度分別為：氯化鈉8.5g/L、磷酸二氫鈉0.3g/L和磷酸氫二鈉2.2g/L。(2)配制提取緩沖液每1000ml上述PBS緩沖溶液中分別添加不同量(見表1和表2)的吐溫-20(Tween-20)，輕輕振蕩混勻后，配制得到18個不同Tween-20濃度(見表1和表2)的-->PBST(PBS+Tween-20)水溶液，作為實驗組提取緩沖液。同時以上述PBS緩沖溶液作為對照組提取緩沖液。表1實驗組提取緩沖液中Tween-20的添加量及濃度(0.05％-0.50％)表2實驗組提取緩沖液中Tween-20的添加量及濃度(0.01％-0.09％)3、提取普氏野馬免疫球蛋白將步驟1采集的雌性普氏野馬糞便和雄性普氏野馬糞便分別混勻(混勻方法：稱取每個個體三天內每天采集的糞樣各100g，粉碎機(23000r)粉碎10min，將混勻的樣品分小袋保存備用)后，分別稱取雌性普氏野馬糞便和雄性普氏野馬糞便1g于15ml塑料離心管中，分別加入10ml步驟2中配制好的實驗組提取緩沖液和對照組提取緩沖液，用渦旋儀在1200rpm振蕩10min混勻，得到混合物；將所述混合物用低速離心機(LDZ5-2型臺式低速離心機)在轉速為2000rpm和溫度為25℃的條件下離心20min，取上清液I1ml于2ml塑料離心管中，將所述上清液I用高速冷凍離心機(Heal?ForceNeofuge?15R臺式高速冷凍離心機)在轉速為10000rpm和溫度為4℃下離心10min，取上清液II，即得到免疫球蛋白。取上清液II于2ml塑料離心管中，于-20℃冷凍保存待測。每個樣品設三次重復。(二)檢測購買針對所要檢測的免疫球蛋白專一的酶聯免疫吸附試劑盒，嚴格按試劑盒說明書操作。所用試劑盒是上海越研生物科技有限公司生產的馬免疫球蛋白IgA酶聯免疫吸附試劑盒。試劑盒的主要參數為：(1)測定范圍：5μg/ml-100μg/ml；(2)靈敏度：＜2.5μg/ml；(3)平均回收率：96-101％；(4)變異系數：批內＜6％；(5)特異性：IgA與IgM、IgG和IgE交叉反應均＜0.01％。該試劑盒中含有如下試劑：包被原為純化的馬IgA抗體、標準品為馬IgA、酶標二抗為HRP標記的IgA抗體、洗滌液(50mM?Tris，0.14M?NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)和終止液(0.18M?H2SO4)和樣品稀釋液(50mM?Tris，0.14M?NaCl，1％BSA，0.05％Tw本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種提取動物免疫球蛋白的方法，包括以下步驟：將動物糞便與提取緩沖液混合，得到混合物；將所述混合物離心，取上清液，即得到所述動物免疫球蛋白；所述提取緩沖液由ＰＢＳ緩沖液和吐溫－２０組成。

【技術特征摘要】
1.一種提取動物免疫球蛋白的方法，包括以下步驟：將動物糞便與提取緩沖液混合，得到混合物；將所述混合物離心，取上清液，即得到所述動物免疫球蛋白；所述提取緩沖液由PBS緩沖液和吐溫-20組成。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述提取緩沖液中，所述吐溫-20的體積百分比濃度為0.01％-0.5％或0.03％-0.07％或0.03％或0.04％或0.05％或0.06％或0.07％。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述離心的方法包括以下步驟：將所述混合物進行第一步離心，取上清液，記作上清液I；將所述上清液I進行第二步離心；所述第一步離心的轉速為2000rpm、溫度為25℃和時間為20min；所述第二步離心的轉速為10000rpm、溫度為4℃或25℃和時間為10min。4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在將所述混合物...

【專利技術屬性】
技術研發人員：葛興芳，胡德夫，楊亮亮，于小杰，郎冬梅，王毅花，
申請(專利權)人：北京林業大學，
類型：發明
國別省市：11