人類附睪表達精子結合蛋白ＨＥＬ－５９及其編碼基因與應用制造技術

本發明專利技術屬于生物技術和醫學領域。本發明專利技術公開了一種新的人附睪特異表達精子結合蛋白ＨＥＬ－５９及其制備和應用。公開了本發明專利技術編碼ＨＥＬ－５９蛋白的氨基酸序列，提供攜帶編碼本發明專利技術蛋白的ＤＮＡ序列的重組表達載體。該蛋白定位于成熟精子頭后區域，ＲＴ－ＰＣＲ結果顯示該基因主要在附睪、睪丸、心、肝組織均有表達。用Ｗｅｓｔｅｒｎ？ｂｌｏｔ在附睪體部檢測到一條３２ＫＤ左右條帶。ＨＥＬ－５９蛋白可作為免疫性避孕藥的研發，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白。基于ＨＥＬ－５９蛋白開發的相應基因或蛋白檢測方法，將廣泛用于生殖醫學研究領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物技術與醫學領域。具體地說，本專利技術涉及一種新的人類附睪表達 精子結合蛋白HEL-59及其編碼基因與應用
技術介紹
本世紀人類的發展面臨著兩個嚴峻的問題一方面，全球人口在急速膨脹，預計在 2050年將達到90億；另一方面，據世界衛生組織調查，大約15%的夫婦存在著不育問題，發 達國家不育癥的發病率在最近IO年飚升，歐洲發達國家可高達30%，其中男性因素約占一 半。世界衛生組織預測，隨著環境污染和性傳播疾病等致病因素的增加，本世紀，不育癥將 成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社會和醫學界的足夠重 視，因此有關男性生殖健康的研究進展緩慢，明顯落后于其它學科。缺少分子生物學層面診 斷與治療不育癥的有效方法。由于精子發育障礙不能自然受精，需要醫生通過做試管嬰兒 獲取后代。利用此種技術獲取后代，不僅耗費了寶貴的時間與資金，而且存在很多影響健康 的潛在因素，失去了正常生育過程中精卵天然結合、優勢選擇遺傳后代的機會。給家庭與社 會帶來了沉重的精神和經濟負擔。 全世界人口的急劇增長造成了資源耗竭和環境惡化，成為人類健康與生存的嚴重 威脅。當前世界人口已超過60億，據專家估計，中國資源環境能支撐的最大人口容量為 15-16億。目前可供人類選擇的避孕措施還很有限，離高效、安全、可逆的標準還相差較 遠。發展安全有效、先進實用的避孕節育新技術、新產品，以滿足不同人群、不同層次的避孕 用藥的個性化要求是近年來國內外避孕節育技術發展的總趨勢。 附睪是精子成熟的重要器官，睪丸產生的精子需要通過與附睪管腔微環境相互作 用才能獲得運動、受精、防御和維持正常胚胎發育以及防御等生物學功能。附睪內大約有 200余種分泌蛋白與精子相互作用，參與精子成熟過程，但是人們對這些蛋白的功能知之甚 少。與精子成熟相關的附睪蛋白的研究將有助于推動男性生殖醫學的研究進展，為男性不 育癥的診斷和治療以及開發新型避孕藥物提供侯選分子靶標，同時有可能對附睪環節的男 性避孕帶來新的思路和突破。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種新的人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59。 —種人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或 將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列 2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質或多肽。本專利技術的人附睪分泌蛋白命名為HEL-59，由289個氨基酸殘基組成。HEL-59蛋 白存在有1個N糖基化位點，9個N-十四烷酰基化位點和8個磷酸化位點，包括3個酪蛋白 激酶II磷酸化位點以及4個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點。 本專利技術的第二個目的是提供編碼人類附睪表達蛋白HEL-59的基因。它是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注冊號為EU794626 ; 編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質序列的多核苷酸； 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質 的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全長c D N A序列為1316bp，定位于人5號染色體上，編 碼289個氨基酸，編碼蛋白為HEL-59，含有信號肽，其開放閱讀框為870bp，是一個完整的讀 碼框。 本專利技術的第三方面，提供了采用基因工程技術制備具有人類附睪表達精子結合蛋 白HEL-59活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉化或轉 導的宿主細胞。 本專利技術的第四方面，提供了與上述人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59特異性結合的抗體，以及由此開發的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。 本專利技術的第五方面，提供了檢測樣本中是否存在人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59的方法，它包括將待測樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀察是否形成抗原抗體復合物，有抗原抗體復合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。 本專利技術的第六方面，提供了本專利技術蛋白和其編碼序列的用途。例如本專利技術蛋白可被作為診斷不育癥的分子靶點，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，或作為開發新型避孕藥物的靶分子，或被用于篩選促進人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59活性的激動劑，或被用于篩選抑制人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59活性的拮抗劑，或被用于肽指紋圖譜鑒定。根據人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59的編碼序列或其片段，可設計引物或探針用于PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。本專利技術蛋白還可用于藥物組合物，以此作為有效活性成分，用于生產一種對抗病原微生物感染以及腫瘤等疾病的藥物。 本專利技術的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本專利技術所述的蛋白、核苷酸序列、構建物或細胞，以及藥學上可接受的載體。 本專利技術的蛋白能夠在附睪內特異性表達，定位于精子頭后部，因此可能與精卵識 別、運動、受精有關。因為它是一種天然的蛋白多肽，可以預見可能具有較少的副作用，本發 明的其他優點可從以下的詳細描述獲知。附圖說明 圖1. HEL-59蛋白在人精子上的免疫熒光定位 紅色熒光顯示精子核；綠色熒光顯示HEL-59蛋白在精子上的定位； A組陽性對照，A3顯示HEL-75蛋白結合于整個精子(文章已發表)； B組陰性對照。 C組HEL_59蛋白定位，C3.顯示HEL-59蛋白結合在精子頭后部。 比例尺5mm。 圖2HEL-59基因組織表達圖譜 1附睪頭2附睪體3附睪尾4睪丸5心6肝7脾8腎9胃10陰性對照 圖3. HEL-59蛋白在附睪液表達的western blot結果 M -Marker ;1 :陽性對照，HEL-75蛋白；2 :陰性對照，小鼠血清;3 :HEL_59蛋白 本專利技術的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的變異 形式，這些變異形式包括(但并不限于)相對于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(通常為 1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳的1-10個)氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可發生在C末端和/或N末端(通常有20個以內，較佳地 為10個以內，更佳地為5個以內的氨基酸缺失或增加)，在本領域中，用性能相近或相似的 氨基酸進行取代時，通常不會改變氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置換表是 本領域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術語還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。 本專利技術的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對 于PCR擴增法，可根據本專利技術所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引 物，用本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA文庫作為模板，擴增而得有關序列。 這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得 到有關序列。 本專利技術中，使用本領域技術人員已知的常規方法將包含編本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人類附睪表達精子結合蛋白ＨＥＬ－５９，其特征在于，它具有序列表中序列２的氨基酸序列或將序列２的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列２的氨基酸殘基序列相同活性的序列２衍生的蛋白質和通過化學方法合成的蛋白質。

【技術特征摘要】
一種人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列2衍生的蛋白質和通過化學方法合成的蛋白質。2. —種人類附睪表達精子結合蛋白HEL-59的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。3. 含有權利要求2所述基因的真核和原核...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李建遠，
申請(專利權)人：李建遠，
類型：發明
國別省市：37[中國|山東]