一種T載體介導(dǎo)的測(cè)定5′端側(cè)翼未知序列的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)是一種涉及限制性內(nèi)切酶酶切、pUCm-T載體和巢式PCR擴(kuò)增等技術(shù)，基于已知DNA序列確定其5′端側(cè)翼未知DNA序列的方法。該方法通過(guò)選用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，純化的酶切產(chǎn)物用Taq酶或Ex?Taq酶進(jìn)行補(bǔ)齊和3′端加A反應(yīng)，與pUCm-T載體連接；利用引物設(shè)計(jì)軟件選定T載體上T/A克隆位點(diǎn)上游的一段序列作為5′端引物，選定兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的互補(bǔ)序列作為3′端引物；以pUCm-T載體連接物為模板，采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，并對(duì)其擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆和測(cè)序。本發(fā)明專利技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣、操作限制少、結(jié)果驗(yàn)證簡(jiǎn)捷、未知序列長(zhǎng)度不限和成本低廉等特點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種ｐＵＣｍ－Ｔ載體介導(dǎo)的ＰＣＲ擴(kuò)增已知ＤＮＡ序列５′端側(cè)翼未知序列的方法，其特征在于：選用限制性內(nèi)切酶酶切基因組ＤＮＡ；純化的酶切產(chǎn)物用Ｔａｑ酶或Ｅｘ　Ｔａｑ酶補(bǔ)齊和３′端加Ａ，與ｐＵＣｍ－Ｔ連接；利用引物設(shè)計(jì)軟件選定Ｔ載體Ｔ／Ａ克隆位點(diǎn)上游的一段序列作為５′端引物、兩條靠近未知序列端的已知ＤＮＡ序列上的互補(bǔ)序列作為３′端引物；以ｐＵＣｍ－Ｔ連接物為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行巢式ＰＣＲ擴(kuò)增以獲取已知ＤＮＡ序列５′端側(cè)翼的未知序列；（１）ＰＣＲ引物的設(shè)計(jì)：基于已知ＤＮＡ序列設(shè)計(jì)兩條３′端特異性引物，命名為Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ１和Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ２（１８－２２ｂｐ）；Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ２的３′端距待測(cè)序列要保留３０ｂｐ以上長(zhǎng)度，它比Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ１接近待測(cè)的未知序列；針對(duì)本專利技術(shù)引入的ｐＵＣｍ－Ｔ載體，在其Ｔ／Ａ克隆位點(diǎn)的上游選定一條５′端特異性引物，命名為Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＦ（２１ｂｐ，Ｔｍ值６０℃）；（２）限制性內(nèi)切酶的選擇：根據(jù)對(duì)已知ＤＮＡ序列上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的分析，選用從Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ１到待測(cè)的未知序列之間沒(méi)有酶切位點(diǎn)的兩種內(nèi)切酶；本專利技術(shù)可供選擇的常用的產(chǎn)生５′粘性末端的限制性內(nèi)切酶有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅡ、ＳａｌⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＮｃｏⅠ、ＸｂａⅠ和ＸｈｏⅠ等；產(chǎn)生平齊末端的有ＥｃｏＲⅤ、ＳｎａＢⅠ和ＳｃａⅠ等；產(chǎn)生３′粘性末端的有ＢｍｔⅠ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ和ＫｐｎⅠ等；（３）ＰＣＲ模板的構(gòu)建：運(yùn)用步驟（２）選擇的兩種內(nèi)切酶對(duì)基因組ＤＮＡ進(jìn)行酶切，純化的酶切產(chǎn)物用Ｔａｑ酶或Ｅｘ　Ｔａｑ酶進(jìn)行補(bǔ)齊和３′端加Ａ反應(yīng)，與ｐＵＣｍ－Ｔ載體連接，即可作為ＰＣＲ模板；此步驟若選用的兩種內(nèi)切酶都是５′粘性或平齊末端，只需選用普通Ｔａｑ酶，否則需要選用帶有３′→５′外切酶活性的Ｅｘ　Ｔａｑ酶；（４）巢式ＰＣＲ擴(kuò)增：以步驟（３）的Ｔ載體連接物為模板，采用Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＦ和Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ１為引物進(jìn)行第一輪ＰＣＲ擴(kuò)增；再以首輪ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用Ｔ－ＰｒｉｍｅｒＦ和Ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ２為引物進(jìn)行第二輪ＰＣＲ擴(kuò)增；將兩輪ＰＣＲ（巢式ＰＣＲ）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)巢式ＰＣＲ原理可以快速驗(yàn)證其擴(kuò)增的產(chǎn)物是否為目的片段。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄔敏辰，唐存多，高金湖，譚中標(biāo)，李劍芳，陳偉，張慧敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：32