本發明專利技術提供了利用蚯蚓生物標志物診斷土壤污染狀況的方法，屬于土壤污染監測與控制技術領域。該方法以人工養殖蚯蚓為標準試驗動物，以氧自由基、丙二醛含量、蛋白質羰基含量以及還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例4種氧化損傷測試指標為診斷土壤污染的生物標志物，以清潔人工土壤為標準土壤，通過分析清潔人工土壤和供試土壤培養一定時間后蚯蚓體內4種氧化損傷指標的差異，可快速靈敏地診斷供試土壤污染狀況。本發明專利技術可用于全面診斷土壤污染狀況和健康程度，該方法對土壤中的痕量污染物有很好的敏感性，可作為土壤污染早期預警的監測方法。與化學分析方法相對，本發明專利技術具有操作簡單，成本低廉的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種土壤污染監測的方法，具體說是土壤污染狀況的蚯蚓生物標志物 診斷方法，即利用蚯蚓體內的氧化損傷指標監測土壤污染狀況，包括重金屬污染和有機物 污染等。
技術介紹
近年來，隨著工農業生產的迅速發展，大量污染物通過多種途徑進入土壤環境中 并共存，我國面臨的土壤污染呈日益加劇趨勢。土壤是環境的重要組成部分，同時也是各種 污染物質的最終載體，承擔著環境中大約90%來自各方面的污染物質，當外來的污染物超 過土壤的自凈能力時，就會破壞土壤的正常機能，使之失去自然生態平衡，成為我們生活中 的化學定時炸彈，從而嚴重影響農產品產量和品質。污染土壤的污染物的種類繁多，既有無 機污染物，同時存在無機污染物。這些污染物主要來自工業三廢和農藥、化肥的大量使用， 它們可通過灌溉水進入土壤，也可通過大氣污染、空中的顆粒物(含重金屬和致癌物質等) 沉降造成。這些污染物不是以單一形式存在土壤環境中，而是同時存在，構成復合污染，使土 壤的污染問題更加嚴重和復雜。采用化學分析方法僅能檢測土壤中某些部分污染物含量， 但無法全面評價土壤健康程度和污染狀況，目前普遍采用生物監測方法來評價土壤總體健 康程度和污染狀況。蚯蚓作為一種古老的生物在自然界已經存在6億年之久，是土壤中生物量最大的 動物類群之一，是土壤系統中重要的組成部分，其挖掘和飲食活動有助于顯著增加水分滲 入，土壤通氣性，土壤團粒結構的穩定。此外，蚯蚓通過形成了有機質有助于增加表層土壤 肥力。這些使蚯蚓成為很好的表征土壤污染的指示生物。蚯蚓的生理代謝及生命活動在一 定程度上反映了土壤的生態功能，因此可以應用生物標志物來評價土壤生態功能并判定土 壤污染狀況和環境質量，某些生物標志物還可對復合污染的效應做出客觀的判斷，這是化 學檢測方法通常難以做到的。蚯蚓已被廣泛應用于土壤污染的環境評估，是標準毒理實驗 的典型生物。蚯蚓生物標志物可以作為早期預警系統或污染危害的準確測量的有效工具。近年來，細胞或分子水平上的生物標志物作為污染物暴露和毒性效應的早期響應 指標在生態毒理學研究中越來越受重視，其中活性氧及抗氧化防御系統各種組分就是廣受 關注的一類重要指標。許多研究表明，通過誘導產生活性氧，引起生物體氧化損傷是污染物 致毒的重要路徑之一。蚯蚓在受到活性氧自由基的攻擊后，抗氧化防御系統會激發相關的 抗氧化酶進行保護防御，但是在大量自由基的攻擊下，機體將會產生一些損傷，例如產生脂 質過氧化、蛋白質產生氧化損傷等。在土壤污染生態毒理學研究領域，生物體抗氧化防御系 統響應變化已開始廣泛應用于評價污染土壤健康和污染狀況，是土壤污染生態毒理診斷的 一項重要指標。但對于如何將與蚯蚓相關的這些指標系統的用與診斷土壤污染狀況仍是 沒有相關文獻給出說明。
技術實現思路
1.專利技術要解決的技術問題 針對現有環境土壤中的污染物種類繁多，化學分析方法只能對有限的污染物進行分析 監測，無法全面評價土壤健康程度和污染狀況，本專利技術提供一種利用蚯蚓生物標志物診斷 土壤污染狀況的方法，采用蚯蚓的氧化損傷生物標志物作為評價指標，可對土壤總體健康 程度和污染狀況進行監測與全面綜合評價。2.技術方案本專利技術的原理是利用土壤污染物可誘導蚯蚓體內產生氧自由基，造成氧自由基(R0S)、 丙二醛含量(MDA)、蛋白質羰基含量(PCO)和還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值(GSH/ GSSG)發生變化，蚯蚓機體在受到氧化損傷時的指標丙二醛MDA和羰基含量PCO間接反應土 壤污染物濃度，可以作為土壤污染生態的生物標志物。生物體的活性氧代謝及抗氧化防御 系統的變化對污染物脅迫的響應相當敏感，可為污染物暴露和毒性效應提供敏感信息。這 4種氧化損傷指標變化程度可間接反映出土壤污染狀況和健康程度。本專利技術的技術方案為，其步驟為(a)稱取200g-500g的人工標準土壤和供試土壤，分別放置不同容器中，水份含量保 持在 30-50% ；(b)在人工標準土壤和供試土壤中分別投入10-30條健康成年且已清腸24小時的人工 養殖蚯蚓，在20-25 °C條件下培養3-20天；(c)從土壤分離出蚯蚓，放入裝有濕濾紙的培養皿中清腸12-24小時，然后分別測定蚯 蚓體內氧自由基(R0S)、丙二醛含量(MDA)、蛋白質羰基含量(PCO)和還原型谷胱甘肽-氧化 型谷胱甘肽比例(GSH/GSSG)；(d)通過比較人工標準土壤組和供試土壤組蚯蚓體內氧自由基(R0S)、丙二醛含量 (MDA)、蛋白質羰基含量(PCO)和還原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例(GSH/GSSG)的差 異，對供試土壤污染狀況進行診斷。步驟(a)中的人工標準土壤是OE⑶人工土壤(2007)，具體配方為工業石英砂 69% (含50%以上0. 05-0. 2 mm細小顆粒)，高嶺土 20%，苔蘚土 10%，CaCO3 1%,混勻，以1 M 的NaOH調節土壤pH為6. 5。步驟(b)中人工養殖蚯蚓方法為以人工土壤為培養介質，用清潔牛糞或豬糞(符 合生物有機肥料行業標準NY884-2004)為蚯蚓食物，20_25°C養殖；蚯蚓品種為赤子愛勝蚓 (Esisenia /eiit/a )，安德愛勝蟲引(Ai1Sewia andrei)、參 V{、毛絕 \(J%eretima aspergillum)寸。步驟(c)中4種氧化損傷指標的檢測方法為(1)氧自由基(R0S):蚯蚓用冰冷的生理鹽水沖洗后，迅速稱量0. 1 g置于玻璃勻漿器 內，加入1 mL二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制的濃度為50 mM的PBN溶液(加入過程中，避免 水分進入，影響EI^R波譜信號)。冰浴條件下勻漿后，將勻漿液密封好，在4°C條件5000rmp離 心5min，取上層液400 mL注入直徑為3 mm石英管中，迅速放入液氮中保存。樣品在電子順 磁共振儀(ΕΠΟ上測定。整個操作過程在以導入氮氣與氧氣隔絕的密閉操作箱中進行，并避 免水分沾入。電子順磁共振儀(EPR)操作參數測試溫度(TE)室溫，微波功率(SP)20mW，微波頻率(SF) 9. 751GHz，調制頻率(MF) IOOKHz，調制幅度(MA)O. 5G，中心磁場(CF) 3470G, 掃場時間(TI)84s，時間常數(TC)41ms，掃場寬度(SW) 200G，信號為5次疊加。(2) 丙二醛含量(MDA)取蚯蚓組織勻漿液200 μ L，按如下順序依次加入8. 1% SDS, 0. 2 mL 20% 醋酸緩沖液(pH 3. 5) 1. 5 mL，1% TBA 1. 5 mL，蒸餾水 1 mL。將上述反應 液于90° C水浴60 min，冷卻后，3000 r/min離心15 min，取上清液在532 nm處測OD值， 脂質過氧化產物MDA以每毫克蛋白中含TBARS的量即TBARS nmol/mg表示，摩爾消光系數 e=l. 56X105/ (mol-I^-cm)。(3) 蛋白質羰基含量(PCO)用50 mM磷酸鉀(pH 7.4)緩沖液(內含1 mM Na2EDTA，0. 1% Triton X-100 (w/v), 1 mM PMSF, 5 mg/L Ieup印tin)提取4￡蚓的粗蛋白液， 用1% (w/v)鏈霉素溶液沉淀可能存在的核酸，取0.8 mL提取液與0.2 mL 20 m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種利用蚯蚓生物標志物診斷土壤污染狀況的方法，其步驟包括：（ａ）稱取２００ｇ－５００ｇ的人工標準土壤和供試土壤，分別放置不同容器中，水份含量保持重量百分比為３０－５０％；（ｂ）在人工標準土壤和供試土壤中分別投入１０－３０條健康成年的人工養殖蚯蚓，在２０－２５℃條件下培養３－２０天；（ｃ）從土壤分離出蚯蚓，放入裝有濕濾紙的培養皿中清腸１２－２４小時，然后分別測定蚯蚓體內羥自由基、丙二醛含量、蛋白質羰基含量和還原型谷胱甘肽－氧化型谷胱甘肽比例；（ｄ）通過比較人工標準土壤和供試土壤培養的蚯蚓體內羥自由基、丙二醛含量、蛋白質羰基含量或還原型谷胱甘肽－氧化型谷胱甘肽比例之間的差異，對供試土壤污染狀況進行診斷。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉蓉，謝顯傳，薛銀剛，顧雪元，耿金菊，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：84
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