本發明專利技術屬于分析檢測技術領域，公開了一種靈敏檢測多種樣品中三聚氰胺的毛細管電泳方法。該方法通過兩種在線富集技術(陽離子耗盡進樣和膠束掃集)聯用測定三聚氰胺，使三聚氰胺的富集靈敏度與普通的區帶毛細管電泳相比提高了2600倍，檢出限降低為1.8μg/kg。本發明專利技術采用低電滲流下的電動進樣，對進入毛細管中的樣品有選擇性，受樣品基質影響小，不需要如液相色譜等方法中復雜的樣品預處理過程，適用于多種樣品中三聚氰胺的檢測；靈敏度高，比已有的液相色譜、熒光光譜法的檢出限降低兩到三個數量級；所用的緩沖液主要是水溶液，無需大量使用有機溶劑，污染小，環境友好；所需溶劑和樣品用量小，使用的空心毛細管柱價格便宜，分析成本低。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分析檢測
，公開了采用簡單的樣品預處理方法聯用毛細管電 泳在線富集技術檢測奶粉、動物飼料等多種樣品中三聚氰胺的方法。
技術介紹
三聚氰胺(Melamine)，是一種重要的氮雜環有機化工原料，由于三聚氰胺分子中 含有大量氮元素，不法分子為了虛假提高蛋白質含量而在飼料以及乳制品中添加三聚氰胺 的現象是屢禁不止的，導致牛奶、蛋類等生活必需品可能含有超過限量值(雞蛋中的限量 值2. 5mg/kg，嬰幼兒配方乳粉中限量值lmg/kg，液態奶、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的 限量值2. 5mg/kg)。在2008年，中國有超過51900多個嬰幼兒因為食用了含有三聚氰胺的 配方奶粉而患上泌尿疾病。自2008年發生三聚氰胺乳品事件后，2010年出現了封存的超 過三聚氰胺臨時管理限量值乳粉回流市場的問題，三聚氰胺又引起公眾的強烈關注。研究 建立快速測定食品、乳制品中三聚氰胺含量的高靈敏分析方法，就具有十分重要的實際意 義和應用價值。目前關于三聚氰胺測定方法有GC-MS、HPLC、LC-MS毛細管電動色譜法和 熒光光度法等方法。這些方法中，有的方法需要比較復雜的樣品預處理過程去除樣品中的 基質影響和比較特殊的填充柱，有的方法的檢測靈敏度比較低。這些方法的檢測靈敏度在 10. 9 μ g/kg 和 0. 25mg/kg 之間。
技術實現思路
為了解決上述現有技術的不足之處，本專利技術的首要目的在于提供一種樣品預處 理手段簡單，檢測靈敏度高的毛細管電泳在線富集技術-陽離子耗盡進樣聯用膠束掃集 (CSEI-sweep MEKC)方法。本專利技術的目的通過下列的技術方案實現一種利用兩種在線富集技術(陽離子耗 盡進樣和膠束掃集)聯用的膠束毛細管電泳方法，該方法的檢測步驟如下(1)將三聚氰胺標準品溶解在20%甲醇水溶液中，配制成濃度為2. 000g/L的儲備 液，避光4°C保存。使用時根據需要稀釋成不同濃度的標準液。在普通的區帶毛細管電泳 (CZE)和陽離子耗盡進樣聯用膠束掃集的模式下，在最佳檢測條件下，對三聚氰胺的標準品 進行毛細管電泳分析，得到標準譜圖。(2)采用QE和CSEI-swe印MEKC方法在最佳檢測條件下，對樣品的提取液進行分 析，獲得樣品的毛細管電泳圖。(3)根據三聚氰胺的校正曲線方程，計算出步驟O)中不同樣品中三聚氰胺的含量。所述最佳檢測條件為CZE電泳條件壓力進樣3kPa，進樣時間15s，運行緩沖液20mmol/L磷酸二氫鈉 (NaH2PO4) 10% (體積分數)甲醇(pH 2. 2)，三聚氰胺溶液(8mg/L)配制在運行緩沖液中。CSEI-sweep MEKC方法首先在毛細管內充滿非膠束背景緩沖液(NBGE)，然后在毛細管中加壓注入一段水柱(30s，P = 3kPa)，樣品采用電動進樣(60s，20kV)，水柱提供的 高電場使樣品快速向出口端遷移，同時在電滲流的作用下水柱向進口端遷移，由進口排出。 樣品離子遷移到水和低PH背景電解質的界面，背景電解質的低電場降低了樣品的遷移速 度，形成一段樣品區帶。進樣完畢后進出口端均換上低PH膠束背景電解質，在負壓(_18kV) 下，運用膠束掃集樣品區帶，使樣品區帶更窄。非膠束背景電解質緩沖溶液(NBGE)的組 成為20mmol/L NaH2PO4 (ρΗ 2. 2)、10 % 甲醇(ν/ν)。樣品基質為0. lmmol/L NaH2PO4(pH 2. 2)-20%乙腈。三聚氰胺溶液(0. 6mg/L)配制在樣品基質中。運行緩沖液組成120mmol/ L SDS-20mmo 1/LNaH2PO4 (pH 2.2)-10% 甲醇(ν/ν)。步驟ο)中配方奶粉和動物飼料中三聚氰胺的樣品預處理過程按照以下步驟進 行分別稱取2. OOOg動物蛋白飼料和牛奶，加入3mL乙腈，超聲lOmin，以7000r/min離心 6min，吸出上清液，在下層沉渣中再加3mL乙腈，操作方法同上，反復提取三次，合并上清 液，并將其放入冰箱內冷凍5min，取出后用普通濾紙過濾，然后用0. 45 μ m過濾膜過濾得樣 品溶液。所有溶液進入毛細管前均經過0. 45 μ m過濾膜過濾，經超聲脫氣后使用。對毛細管進行如下處理毛細管在使用時，分別用0. lmol/L HCI、超純水、0. lmol/L NaOH、超純水、非膠束 背景緩沖液沖洗lOmin。兩次MEKC樣品分析運行期間，分別用0. Imol/LNaOH、超純水、非膠 束背景緩沖液沖洗5min，以獲得良好的分離檢測重現性。在最佳的富集檢測條件下，三聚氰胺的富集倍數比普通區帶毛細管電泳法提高了 沈00倍。方法的線性范圍為2-1000 μ g/L，檢出限為0. 77yg/kg(S/N = 3)，遷移時間和峰 面積的相對標準偏差(RSD)分別小于5. 2^^Π3.5%。本專利技術相對于現有技術，具有如下的優點及有益效果(1)本專利技術為多種樣品中 三聚氰胺的檢測提供技術支持；( 環境友好，經濟環保，所用的緩沖液多為水相，無需消 耗大量的有機溶劑，比液相色譜更環保，更有利于檢測者的身體健康；C3)分析成本低，所 需樣品和溶劑都很少，檢測一個樣品消耗的緩沖溶液不到lmL，且不需要特殊的色譜柱，僅 使用普通的空心毛細管柱，價格比一般的色譜柱要低好幾倍，使用方便；(4)本專利技術所采用 的在線富集技術使三聚氰胺的檢測靈敏度提高了 3個數量級左右，遠遠低于一般常用的檢 測手段；(5)運用了電進樣方式，時樣品是通過電泳作用力引入到毛細管中的，在正向電壓 下，只有陽離子化合物才能進入毛細管中，而基質中一些中性分子或者陰離子化合物就不 能進入毛細管中，從而能克服測量樣品中存在的一部分干擾，不需要采用常規的較為繁瑣 的預處理方法也可以達到靈敏的檢測效果附圖說明圖1為三聚氰胺標準品的CZE 2 為 CSEI-swe印 MEKC 3為空白配方奶粉樣品提取液4為加標的配方奶粉樣品提取液圖具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步說明。所需的儀器裝置為CAPEL105高效毛細管電泳系統，配有紫外檢測器；未涂層石 英毛細管(φ75 μ mX65cm，有效長度50cm)。所需試劑三聚氰胺標準品，十二烷基硫酸鈉(SDS)，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，磷酸，乙腈，甲 醇，0. lmol/LHCl，0. Imol/LNaOH,超純水，所用緩沖液及樣品溶液均經過0. 45 μ m過濾膜過 濾后使用。1)最佳檢測條件的確定(1)運行液和樣品基質的配制用超純水分別配制濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液；a.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液，配制十二 烷基硫酸鈉濃度分別為30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L和120mmol/L的15mmol/L磷酸二氫 鈉-體積比10%甲醇緩沖液，用5mmol/L氫氧化鈉和磷酸調節pH為2. 2。b.利用濃度為120mmol/L NaH2PO4和150mmol/L十二烷基硫酸鈉母液，配制磷 酸二氫鈉濃度分別為 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L 和 30mmol/L 的 120mmol/L十二本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品中的三聚氰胺的方法，其特征在于：包括如下步驟：（１）將三聚氰胺標準品溶解在２０％甲醇水溶液中，配制成濃度為２．０００ｇ／Ｌ的儲備液。避光４℃保存。使用時根據需要稀釋成不同濃度的標準液。在普通的區帶毛細管電泳（ＣＺＥ）和陽離子耗盡進樣聯用膠束掃集（ＣＳＥＩ－ｓｗｅｅｐ ＭＥＫＣ）的模式下，在最佳檢測條件下，對三聚氰胺的標準品進行毛細管電泳分析。得到標準譜圖。（２）采用ＣＺＥ和ＣＳＥＩ－ｓｗｅｅｐ ＭＥＫＣ方法在最佳檢測條件下，對樣品的提取液進行分析，獲得樣品的毛細管電泳圖。（３）根據三聚氰胺的校正曲線方程，計算出步驟（２）中不同樣品中三聚氰胺的含量。所述最佳檢測條件為：ＣＺＥ電泳條件：壓力進樣３ｋＰａ，進樣時間１５ｓ，運行緩沖液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氫鈉（ｐＨ ２．２）－１０％（體積分數）甲醇，三聚氰胺溶液（８ｍｇ／Ｌ）配制在運行緩沖液中。ＣＳＥＩ－ｓｗｅｅｐ ＭＥＫＣ方法：首先在毛細管內充滿非膠束背景緩沖液（ＮＢＧＥ），然后在毛細管中加壓注入一段水柱（３０ｓ，Ｐ＝３ｋＰａ），樣品采用電動進樣（６０ｓ，２０ｋＶ），水柱提供的高電場使樣品快速向出口端遷移，同時在電滲流的作用下水柱向進口端遷移，由進口排出。樣品離子遷移到水和低ｐＨ背景電解質的界面，背景電解質的低電場降低了樣品的遷移速度，形成一段樣品區帶。進樣完畢后進出口端均換上低ｐＨ膠束背景電解質，在負壓（－１８ｋＶ）下，運用膠束掃集樣品區帶，使樣品區帶更窄。非膠束背景電解質緩沖溶液（ＮＢＧＥ）的組成為：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ２．２）、１０％甲醇（ｖ／ｖ）。樣品基質為：０．１ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ２．２）－２０％乙腈。三聚氰胺溶液（０．６ｍｇ／Ｌ）配制在樣品基質中。根據權利要求１所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品中的三聚氰胺的方法，其特征在于：步驟（２）中配方奶粉、牛奶和動物飼料中三聚氰胺的樣品預處理過程按照以下步驟進行：分別稱取２．０００ｇ動物蛋白飼料、配方奶粉或牛奶３ｍＬ乙腈，超聲１０ｍｉｎ，以７０００ｒ／ｍｉｎ離心６ｍｉｎ，吸出上清液，在下層沉渣中再加３ｍＬ乙腈，操作方法同上，反復提取三次，合并上清液，并將其放入冰箱內冷凍５ｍｉｎ，取出后用普通濾紙過濾，然后用０．４５μｍ過濾膜過濾得樣品溶液。所有溶液進入毛細管前均經過０．４５μｍ過濾膜過濾，經超聲脫氣后使用。根據權利要求１所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品中的三聚氰胺的方法，其特征在于：對毛細管進行如下處理：毛細管在使用時，分別用０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ、超純水、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、超純水、非膠束背景緩沖液沖洗１０ｍｉｎ。兩次ＭＥＫＣ樣品分析運行期間，分別用０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、超純水、非膠束背景緩沖液沖洗５ｍｉｎ，以獲得良好的分離檢測重現性。根據權利要求１所述的一種具有高靈敏度的毛細管電泳在線富集方法測定多種樣品中的三聚氰胺的方法，其特征在于：在最佳的富集檢測條件下，三聚氰胺的富集倍數比普通區帶毛細管電泳法提高了２６００倍。方法的線性范圍為２－１０００μｇ／Ｌ，檢出限為０．７７μｇ／ｋｇ（Ｓ／Ｎ＝３），遷移時間和峰面積的相對標準偏差（ＲＳＤ）分別小于５．２％和３．５％。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳新，劉瑛，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：32
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