本發(fā)明專利技術屬生物化學領域，具體涉及一種活性肽類物質(zhì)組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽（Cyclo(His-Pro)，簡稱CHP）的制備方法。過程主要有氨基全保護的組氨酸的合成、線性二肽的合成、環(huán)二肽合成等步驟。是以組氨酸為原料，包括二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N（α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨酰胺反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽經(jīng)過脫保護環(huán)合反應得到組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽等步驟。本發(fā)明專利技術所述方法具有簡化工藝、降低成本、減少工時、安全操作的優(yōu)良效果，能夠制備高純度、高活性的組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽產(chǎn)品。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本 專利技術屬生物化學領域，具體涉及一種活性肽類物質(zhì)組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽 (Cyclo (His-Pro)，簡稱CHP)的制備方法。
技術介紹
CHP為內(nèi)源性環(huán)狀二肽，廣泛存在人及動物的體液和組織中，具有多方面的生物學 活性，包括對抗乙醇的麻醉、降溫及降低腦中cAMP水平的作用，對治療酒精依賴綜合癥和 糖尿病有一定的作用。其體內(nèi)合成由促甲狀腺素釋放激素(TRH)經(jīng)焦谷氨酸氨肽酶水解， 脫去焦谷氨酸后環(huán)化而成。由于其結(jié)構中的組氨酸和脯氨酸都帶有雜環(huán)結(jié)構，形成環(huán)狀二 肽結(jié)構更為復雜，給體外合成CHP帶來很大的困難，本專利技術采用的液相法生產(chǎn)工藝可以提 供一種有效的體外合成方法。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種工藝簡化、成本降低、工時減少、操作安全的組氨酸-氨 酸環(huán)二液相合成方法。本專利技術是一種液相化學合成法，過程主要有氨基全保護的組氨酸的合成、線性二 肽的合成、環(huán)二肽合成等步驟。是以組氨酸為原料，通過二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得 到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸；N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁 氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨酰胺反應得到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組 氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽；N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨 酰胺線性二肽經(jīng)過脫保護環(huán)合反應得到組氨酸_脯氨酸環(huán)二肽。應用本專利所述方法，還 可以合成其它的線性二肽或環(huán)二肽。具體工藝步驟如下(1)取15克 25克L-組氨酸懸浮于35 70毫升水中，然后加入70 140毫升的四 氫呋喃；在_5°C 5°C條件下，加入50 60克二碳酸二叔丁酯；然后在_5°C 5°C條件下， 以0. 10 0. 20ml/min的速度滴加35 70毫升的10% 20%碳酸鉀水溶液，邊滴加邊攪 拌，滴加完畢后繼續(xù)攪拌20 50分鐘；自然升溫至室溫，反應12 24小時；減壓去除四氫 呋喃，水相用40 80毫升乙醚提取兩次，然后用70 140毫升飽和硫酸氫鉀溶液調(diào)節(jié)pH =1 5 ；將此反應液用乙酸乙酯提取三次，合并提取液，加無水硫酸鎂干燥，減壓除去乙酸 乙酯，即得到N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )_叔丁氧羰基-L-組氨酸白色粉末。(2)取30克 40克得到的N(im)-叔丁氧羰基_Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸懸 浮于150 300毫升四氫呋喃中，加入15 25克N，N'-羰基二咪唑，攪拌使其全部溶解； 攪拌反應20 40分鐘后，在_5°C 5°C條件下加入10 20克的L-脯氨酰胺，加完后，繼 續(xù)攪拌20 50分鐘，自然升溫至室溫，反應12 24小時；減壓去除四氫呋喃，將水相用 40 80毫升乙酸乙酯提取五次，合并提取液，然后用0. 3% 0. 6% (ν/ν)的濃鹽酸/飽和 食鹽水溶液75毫升 150毫升洗滌五次，有機相中加無水硫酸鎂干燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽粉末。(3)在帶有溫度計、pH電極、回流冷凝管、加熱攪拌裝置的容器中，將所得到的 N(im)-叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽分散于30毫 升 60毫升水中，升溫攪拌，在95°C 105°C條件下，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH = 3 7，保溫 反應10 20小時，HPLC監(jiān)測原料消耗完畢后，加入活性炭0. 5克 5. 0克保溫攪拌1 3小時，然后熱過濾，減壓濃縮，甲醇溶解，分散于冰乙醚中，過濾后得到本專利所述的組氨 酸-脯氨酸環(huán)二肽產(chǎn)品。附圖說明 圖1是本專利制備的組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽的HPLC譜圖。具體的分析條件包括 進樣量為5微升；檢測時間為30min;檢測波長為220 nm ；色譜柱型號為Discovery C18 column (250X4. 6mm I. D.);流速為 1. 0 mL/min ；流動性 Buffer A 為 0. 10%TFA+H20 ；流動 相 Buffer B 為 0. 10%TFA+CH3CN ；梯度洗脫條件為 0. 1_50%B in 0-15 minutes。檢測結(jié)果 顯示CHP的保留時間在3. 67583min,峰高是1124. 59mV,峰面積為4388. 59mV. sec,面積百 分比為100%。具體的實施方式實施例1 :N(im)_叔丁氧羰基-Ν( 叔丁氧羰基_L_組氨酸的合成 取19克L-組氨酸懸浮于56毫升水中，然后加入112毫升的四氫呋喃；在0°C條件下， 加入60克二碳酸二叔丁酯；然后在0°C條件下，以0. 15ml/min的速度滴加56毫升的13% 碳酸鉀水溶液，邊滴加邊攪拌，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘，自然升溫至室溫，反應22小時 后，減壓去除四氫呋喃，水相用47毫升乙醚提取兩次，然后用119毫升飽和硫酸氫鉀溶液調(diào) 節(jié)pH = 1 2，將此反應液用乙酸乙酯47毫升提取三次，合并提取液，加無水硫酸鎂28克 干燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )_叔丁氧羰基-L-組氨酸白色 粉末約36克。實施例2 =N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨酰胺線性 二肽的合成取36克得到的N(im) -叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸懸浮于200毫升 四氫呋喃中，加入16克N，N’ -羰基二咪唑，攪拌使其全部溶解，攪拌反應30分鐘后，在0°C 條件下加入12克的L-脯氨酰胺，加完后，繼續(xù)攪拌30分鐘，自然升溫至室溫，反應20小時 后，減壓去除四氫呋喃，將水相用50毫升乙酸乙酯提取五次，合并提取液，然后用0. 5% (ν/ ν)的濃鹽酸/飽和食鹽水溶液100毫升洗滌五次，有機相中加無水硫酸鎂10克干燥，減壓 除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨酰胺線 性二肽粉末約18克。實施例3 組氨酸_脯氨酸環(huán)二肽的合成在帶有溫度計、PH電極、回流冷凝管、加熱攪拌裝置的容器中，將所得到的N(im)_叔丁 氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽分散于50毫升水中，升溫攪 拌，在100°C條件下，滴加濃鹽酸15. 8克保持pH = 6. 5，保溫反應16小時，HPLC監(jiān)測原料 消耗完畢后，加入活性炭0. 5克保溫攪拌1小時，然后熱過濾，減壓濃縮，用50毫升甲醇溶 解，分散于500毫升冰乙醚中，過濾、干燥后得到組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽產(chǎn)品約15. 3克。權利要求1.組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽的制備方法，其包括如下步驟(1)通過二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得到N(im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰 基-L-組氨酸；(2)N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸與L-脯氨酰胺反應得到 N (im)-叔丁氧羰基-N ( α )-叔丁氧羰基_L_組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽；(3)N(im)_叔丁氧羰基-Ν( α )-叔丁氧羰基-L-組氨酸-L-脯氨酰胺線性二肽經(jīng)過脫 保護、環(huán)合反應得到組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽。2.如權利要求1所述的組氨酸-脯氨酸環(huán)二肽的制備方法，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
組氨酸－脯氨酸環(huán)二肽的制備方法，其包括如下步驟： （１） 通過二碳酸二叔丁酯與組氨酸的反應得到Ｎ（ｉｍ）－叔丁氧羰基－Ｎ（α）－叔丁氧羰基－Ｌ－組氨酸； （２） Ｎ（ｉｍ）－叔丁氧羰基－Ｎ（α）－叔丁氧羰基－Ｌ－組氨酸與Ｌ－脯氨酰胺反應得到Ｎ（ｉｍ）－叔丁氧羰基－Ｎ（α）－叔丁氧羰基－Ｌ－組氨酸－Ｌ－脯氨酰胺線性二肽； （３） Ｎ（ｉｍ）－叔丁氧羰基－Ｎ（α）－叔丁氧羰基－Ｌ－組氨酸－Ｌ－脯氨酰胺線性二肽經(jīng)過脫保護、環(huán)合反應得到組氨酸－脯氨酸環(huán)二肽。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：趙春暉，賴宏森，李丹勝，
申請(專利權)人：大連伊美生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：91
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