本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面固定層粘連蛋白的方法。在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面，通過強堿與強酸活化在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面形成反應(yīng)性官能團(tuán)羥基－ＯＨ，然后用硅烷偶聯(lián)劑氨丙基三乙氧基硅烷（ＡＰＴＥ）在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面與生物分子層之間構(gòu)建一層與兩者分別具有化學(xué)鍵合能力的偶聯(lián)層，以提高后續(xù)所固定生物分子的穩(wěn)定性。最后以水溶性碳二亞胺（ＥＤＣ）為固定蛋白的催化劑，固定層粘連蛋白分子，從而在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面牢固形成層粘連蛋白生物化層。本發(fā)明專利技術(shù)在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面牢固結(jié)合固定層粘連蛋白生物化層，顯著提高Ｔｉ－Ｏ薄膜表面的血液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及無機材料表面改性技術(shù)，特別涉及人工器官材料Ti-0薄膜表 面的生物化改性方法。
技術(shù)介紹
鈦基金屬已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而其表面自然形成的Ti-0薄層 被認(rèn)為是鈦具有良好生物相容性的主要原因。但是，就臨床應(yīng)用而言，鈥基金 屬的生物相容性遠(yuǎn)未滿足臨床需要。在生物材料表面進(jìn)行生物大分子固定已經(jīng)成為提高其表面生物相容性的 最優(yōu)方法之一，另外，在材料表面引入細(xì)胞膜受體所能識別的生物特異性蛋白， 將促進(jìn)受體-配體作用，改善生物相容性。層粘連蛋白(Ln)是胚胎發(fā)育中出 現(xiàn)最早的細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此材料表面固定Ln生物分子可促進(jìn)細(xì)胞的粘附 和生長。但層粘連蛋白的長久穩(wěn)定固定通常要求材料表面具有可與其發(fā)生反應(yīng) 的活性基團(tuán)，如羥基(-0H)、氨基(-NH2)、羧基(-C00H );而Ti-0薄膜為 無機材料，無法直接與生物分子發(fā)生作用而將其固定。目前也無將層粘連蛋白 固定到Ti-O薄膜的文獻(xiàn)才艮道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的就在于提供， 用該種方法可在Ti-O薄膜表面牢固固定層粘連蛋白，Ti-O薄膜具有良好的血 液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性。本專利技術(shù)實現(xiàn)以上專利技術(shù)的目的采用的技術(shù)方案是， 一種在Ti-0薄膜表面固 定層粘連蛋白的方法，其步驟為A、 Ti-O薄膜清洗將Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清 洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；B、 強堿活化在50-80。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為 8-12% WT的NaOH溶液中浸泡1-5小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；C、 強酸活化將98% (WT) H2S04與30% (WT) HA按體積比1: 0. 5-3配制混合液，在60-95。C下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡l-4小時，然 后用雙蒸水沖洗，再干燥；D、 偶聯(lián)配制1 - 3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE )的乙醇溶液作為 偶聯(lián)劑溶液，在50-7(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中 24-72小時，然后回流漂洗2-6小時，之后在蒸餾水中超聲清洗，從而在Ti-0 薄膜表面形成偶^:劑單層，然后干燥；E、 生物分子固定配制20-60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入5-15mL/L 的水溶性碳二亞胺(EDC)催化劑，并用0. 22ijm慮膜過濾；在無菌條件下，將 D步獲得的Ti-0薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置6-24 小時，使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗， 常溫晾干，即得。參見說明書附圖1，本專利技術(shù)的反應(yīng)過程與機理是，通過強堿與強酸及HA 溶液浸泡，在Ti-O薄膜表面獲得輕基，然后通過r-氨丙基三乙氧基硅烷的乙 醇偶聯(lián)劑溶液浸泡，使Ti-0薄膜表面的羥基與偶聯(lián)劑的乙氧基團(tuán)反應(yīng)，而在 Ti-O薄膜表面形成偶聯(lián)劑單層，最后，通過在加有水溶性碳二亞胺(EDC)催 化劑的層粘連蛋白溶液中浸泡，使偶聯(lián)劑的氨基與層粘連蛋白的羧基發(fā)生反 應(yīng)，從而在Ti-O薄膜表面固定上層粘連蛋白單層。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是一、 創(chuàng)造性的選擇出活化方式、偶聯(lián)劑和生物分子，從而借助特別的表面 活化-偶聯(lián)-生物分子固定的方法，先將Ti-0薄膜表面活化形成羥基，再通 過羥基構(gòu)建一層偶聯(lián)劑中間層，該中間層與Ti - 0薄膜和生物分子層均能形成 化學(xué)鍵合。這樣， 一方面使層粘連蛋白在Ti-0薄膜表面的固定均勻牢固，另 一方面使得Ti-0薄膜具有優(yōu)異的生物相容性。試驗也證明，用同樣方法固定 纖粘連蛋白，其血小板粘附數(shù)量增加，血液相容性差，而本專利技術(shù)方法在Ti-0 薄膜表面固定層粘連蛋白后同時具有良好的血液相容性和內(nèi)皮細(xì)胞相容性，即 生物相容性好。二、 由于整個過程均采用浸泡方式進(jìn)行，因此可以實現(xiàn)工業(yè)上具有復(fù)雜體 型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置如人工心臟瓣膜、血管支架、血栓濾器等表面層粘連蛋 白生物化修—飾，其適用范圍廣。三、 由于整個過程操作簡單，無需特殊昂貴的設(shè)備，其制作成本低。附圖說明下面結(jié)合附圖和實施例對本專利技術(shù)的方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1為本專利技術(shù)方法各步驟在Ti-0薄膜表面所對應(yīng)產(chǎn)生的共價接枝過程的 示意圖。圖h為未固定層粘連蛋白的Ti-O薄膜表面粘附的血小板的掃描電鏡圖。 圖化為用本專利技術(shù)方法園定層粘連蛋白后的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的 掃描電鏡圖。圖3a為未固定層粘連蛋白的Ti-0薄膜表面生長的內(nèi)皮細(xì)胞的掃描電鏡圖。圖3b為用本專利技術(shù)方法中固定層粘連蛋白后的Ti-O薄膜表面生長的內(nèi)皮細(xì) 胞的掃描電鏡圖。 具體實施例方式實施例1參見圖1,本專利技術(shù)的第一種具體實施方式是， 一種在Ti-0薄膜表面固定 層粘連蛋白的方法，其步驟為A、 Ti-0薄膜清洗將銳鈥礦晶型Ti-0薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水 進(jìn)行超聲波清洗，分別IO分鐘，獲得潔凈的薄膜表面，放入凈化室干燥箱中 進(jìn)行干燥；B、 強堿活化在50。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為10% WT 的NaOH溶液中浸泡3小時，然后用雙蒸水沖洗，再真空干燥；C、 強酸活化將98% (WT) H2S(h與30% (WT) HA按體積比1: 1配制混合 液，在9(TC下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡2小時，然后用雙蒸 水沖洗，再真空干燥；D、 偶聯(lián)配制1% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶 聯(lián)劑溶液,在6(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中48小時， 然后回流漂洗4小時，之后在蒸餾水中超聲清洗3分鐘，從而在Ti-0薄膜表 面形成偶聯(lián)劑單層，然后真空干燥；E、 生物分子固定配制40mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入10mL/L的 水溶性碳二亞胺(EDC )催化劑，并用0. 22pm慮膜過濾；在無菌條件下，將D 步獲得的Ti-0薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置12小時，使層粘連蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗3 分鐘，常溫晾干，即得。 實施例2，其步驟為A、 Ti-0薄膜清洗將以銳鈦礦為主的銳鈦礦與金紅石混合晶型Ti-0薄 膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗，分別8分鐘，獲得潔凈的薄膜 表面，放入凈化室干燥箱中進(jìn)行干燥；B、 強堿活化在80。C振蕩條件下，將潔凈的Ti-0薄膜放入濃度為8% WT 的NaOH溶液中浸泡1小時，然后用雙蒸水沖洗，再真空干燥；C、 強酸活化將98% (WT) HzS04與30% (WT) HA按體積比1: 3配制混合 液，在60'C下，將B步獲得的Ti-0薄膜用該混合液浸泡4小時，然后用雙蒸水沖洗，再真空干燥；D、 偶聯(lián)配制3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶 聯(lián)劑溶液,在5(TC下，將C步獲得的Ti-0薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中72小時， 然后回流漂洗6小時，之后在蒸餾水中超聲清洗3分鐘，從而在Ti-O薄膜表 面形成偶聯(lián)劑單層，然后真空干燥；E、 生物分子固定配制60mg/L濃度的層粘連蛋白溶液，滴入15mL/L的 水溶性碳二亞胺(EDC )催化劑，并用0. 22pm慮膜過濾；在無菌條件下，將D 步獲得的Ti-O薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒溫孵化箱靜置6小時， 使層粘連蛋白本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為： Ａ、Ｔｉ－Ｏ薄膜清洗將Ｔｉ－Ｏ薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥； Ｂ、強堿活化在５０－８０℃振蕩條件下，將潔凈的Ｔｉ－Ｏ薄膜放入濃度為８－１２％ＷＴ的ＮａＯＨ溶液中浸泡１－５小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥； Ｃ、強酸活化將９８％（ＷＴ）Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］與３０％（ＷＴ）Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］按體積比１∶０．５－３配制混合液，在６０－９５℃下，將Ｂ步獲得的Ｔｉ－Ｏ薄膜用該混合液浸泡１－４小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥； Ｄ、偶聯(lián)配制１－３％ｗｔ ｒ－氨丙基三乙氧基硅烷（ＡＰＴＥ）的乙醇溶液作為偶聯(lián)劑溶液，在５０－７０℃下，將Ｃ步獲得的Ｔｉ－Ｏ薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中２４－７２小時，然后回流漂洗２－６小時，之后在蒸餾水中超聲清洗，從而在Ｔｉ－Ｏ薄膜表面形成偶聯(lián)劑單層，然后干燥； Ｅ、生物分子固定配制２０－６０ｍｇ／Ｌ濃度的層粘連蛋白溶液，滴入５－１５ｍＬ／Ｌ的水溶性碳二亞胺（ＥＤＣ）催化劑，并用０．２２μｍ慮膜過濾；在無菌條件下，將Ｄ步獲得的Ｔｉ－Ｏ薄膜浸泡入該蛋白溶液，并于３７±０．５℃恒溫孵化箱靜置６－２４小時，使層粘連蛋白固定到Ｔｉ－Ｏ薄膜表面，最后在磷酸鹽緩沖液中振蕩漂洗，常溫晾干，即得。...
【技術(shù)特征摘要】
1、一種在Ti-O薄膜表面固定層粘連蛋白的方法，其步驟為A、Ti-O薄膜清洗將Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸餾水進(jìn)行超聲波清洗，獲得潔凈的薄膜表面，干燥；B、強堿活化在50-80℃振蕩條件下，將潔凈的Ti-O薄膜放入濃度為8-12％WT的NaOH溶液中浸泡1-5小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；C、強酸活化將98％(WT)H2SO4與30％(WT)H2O2按體積比1∶0.5-3配制混合液，在60-95℃下，將B步獲得的Ti-O薄膜用該混合液浸泡1-4小時，然后用雙蒸水沖洗，再干燥；D、偶聯(lián)配制1-3％wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作為偶聯(lián)劑溶液，在50-70℃下，將C步獲得的Ti-O薄膜浸泡到該偶聯(lián)劑溶液中24-72小時，然后回流漂洗2-6小時...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳俊英，黃楠，葛勝男，冷永祥，楊蘋，王進(jìn)，孫鴻，萬國江，趙安莎，游天雪，吳熹，
申請(專利權(quán))人：西南交通大學(xué)，成都交大麥迪克科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：90[中國|成都]
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