醫用牛頸靜脈帶瓣管道的制備方法技術

本發明專利技術提供了一種醫用牛頸靜脈帶瓣管道的制備方法，該方法采用戊二醛復合鞣制再結合肝素進行處理，使所得產品具有抗原性小，組織相容性好，抗鈣化的優點，與此同時，本發明專利技術所用的材料豐富簡便，經濟，降低了生產成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種醫用生物材料的制備方法，特別涉及一種心外科手術用牛頸靜脈帶瓣管道的制備方法。
技術介紹
在許多心臟及大血管手術中，如法洛氏四聯癥、肺動脈閉鎖、右心室雙出口、永存動脈干、大血管轉位合并肺動脈狹窄以及主動脈病變需行Ross手術者，往往需要應用帶瓣管道重建右心室與肺動脈的連接。常用的材料有自體心包、同種異體主動脈帶瓣管道、異種材料如豬主動脈及肺動脈帶瓣管道、人工材料如Gore-Tex片、人工合成的帶瓣管道等，但這些材料都存在一些局限性，如Gore-Tex片一般不能重建瓣膜結構；自體或牛心包縫制帶瓣管道，瓣膜功能不理想；豬主動脈、肺動脈帶瓣管道已應用于臨床，但易鈣化、衰敗，使用期有限；由于右心系統壓力低，血流速度慢，人工瓣特別是機械瓣置入后血栓栓塞并發癥高；同種異體帶瓣管道自Ross率先應用以來，已有40年歷史并取得了良好的效果，但同種帶瓣管道來源有限，且大小不易匹配，使其臨床應用受到很大的限制。近年來，國外有將帶瓣膜的牛頸靜脈管道用于臨床重建右心室流出道取得良好效果的報道，但作為異體生物材料由于在加工處理過程中的不足，一方面制作成本高，國內患者難于接受，另一方面置入人體后會產生排斥反應、鈣化、衰老等，嚴重地影響了臨床使用效果。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種成本較低，適于國產化的，采用該方法所得的產品抗原性小，組織相容性好，抗鈣化。具體技術方案如下包括以下步驟(1).自屠宰場采集當場宰殺的2-4歲健康牦牛，清潔狀況下取牛頸靜脈全段，用大量自來水沖洗靜脈腔內及外壁后，放置在盛有2～6℃生理鹽水的容器中帶回實驗室；(2).即刻用手術刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪組織，然后用大量生理鹽水沖洗，直到洗去雜質和血醒味；(3).浸泡于2～6℃Hank’s液內3～5小時，然后放入0.5～0.625％戊二醛溶液中在瓣膜關閉狀態下固定45～55小時，溫度22～27℃；(4).用蒸餾水沖洗，待上述浸泡溶液洗干凈以后，浸泡于1％肝素鹽水中20～30小時，22～25℃；(5).再用蒸餾水沖洗，洗去肝素鹽水液后，再浸泡在0.5％戊二醛保存，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌，放入1℃～4℃冰箱仍用0.5％戊二醛保存備用。所述的優選方案是步驟(3)中Hank’s液內浸泡時間最好為4小時，戊二醛溶液中固定時間最好為48小時，溫度為25℃。所述的優選方案是步驟(4)中在 1％肝素鹽水中浸泡時間為24小時，溫度為25℃。1％肝素鹽水是每1毫升肝素加入到99毫升0.9％的生理鹽水中配制而成的。采用該方法制得的產品可以經過常規的取樣，進行細菌培養和霉菌培養，檢測證實無菌后方可使用。近年來，異種器官和組織移植已取得了巨大的成就，手術成功率已明顯提高。但是，術后的免疫排斥反應仍然是移植失敗的最主要原因，因而，消除、減少移植物的抗原性，從而有效控制排斥反應是移植成功與否的關鍵。為了證實該方法處理的產品抗原性小，進行了下述試驗材料和方法一、材料1.實驗動物選取健康新西蘭大白兔15只，雌雄不拘，體重2.0～2.5千克，購自重慶醫科大學動物實驗中心。2.新鮮牛頸靜脈帶瓣管道的制備自屠宰場采集當場宰殺的2-4歲牦牛的頸靜脈，生理鹽水浸泡、沖洗后，剝除多余肌肉和脂肪組織，用1∶1000的新潔爾滅溶液浸泡滅菌2小時，再用抗菌素溶液(每100ml生理鹽水加入青霉素80萬單位，慶大霉素8萬單位)浸泡滅菌20小時，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌，4℃冰箱保存備用。3.新鮮牛頸靜脈帶瓣管道組織勻漿的制備取適量上述新鮮牛頸靜脈帶瓣管道，4℃冰生理鹽水充分漂洗，攪拌器充分搗碎攪勻，勻漿2000轉/分離心10分鐘，過濾取得蛋白上清液，加入1∶2000NaN3防腐，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌，4℃冰箱保存備用。4.戊二醛鞣制牛頸靜脈帶瓣管道的制備取適量上述新鮮牛頸靜脈帶瓣管道，4℃冰生理鹽水充分漂洗后，浸泡于4℃Hank’s液內4小時清除可溶性蛋白，然后放入0.625％戊二醛溶液中固定48小時，溫度25℃；蒸餾水沖洗，將其浸入1％肝素鹽水中24小時，25℃；蒸餾水沖洗，0.5％戊二醛保存，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌，放入4℃冰箱仍用0.5％戊二醛保存備用。5.戊二醛鞣制牛頸靜脈帶瓣管道組織勻漿的制備取適量上述戊二醛鞣制牛頸靜脈帶瓣管道組織，4℃冰生理鹽水充分漂洗，攪拌器充分搗碎攪勻，勻漿2000轉/分離心10分鐘，過濾取得蛋白上清液，加入1∶2000NaN3防腐，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌，4℃冰箱保存備用。二.方法 以15只新西蘭大白兔建立動物模型，隨機分為三組，A組以戊二醛鞣制牛頸靜脈帶瓣管道組織勻漿實驗兔腹腔注射及戊二醛鞣制牛頸靜脈帶瓣管道組織塊實驗兔背部皮下埋藏。B組以無菌新鮮牛頸靜脈帶瓣管道組織勻漿實驗兔腹腔注射及無菌新鮮牛頸靜脈帶瓣管道組織塊實驗兔背部皮下埋藏。C組以生理鹽水實驗兔腹腔注射及生理鹽水實驗兔背部皮下注射。實驗動物于實驗前1天、致敏實驗后1天、致敏實驗后1周、攻擊實驗后1天、攻擊實驗后1周、攻擊實驗后2周分別抽取靜脈血(非抗凝)，用速率散射比濁法測量血清特異性IgG、IgM抗體濃度；用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清TNF-α、IL-6、IL-8細胞因子水平。全部實驗動物于實驗后30天取背部皮下埋藏物及周圍組織作病理學檢查及免疫細胞化學檢查。所得結果用SAS8.02統計軟件進行重復測定的方差分析，結果用F值、P值表示，P＜0.01時認為差異有顯著性。結果 三組實驗動物于實驗前各測量值均無顯著性差異。于實驗后12天B組特異性IgG、IgM抗體及細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8濃度均明顯升高，而A組各種測量值實驗后仍無明顯升高，C組實驗前后各測量值幾乎無變化，B組與A、C組間比較，其差異有顯著性；A組與C組比較，各測量值之變化差異無顯著性。背部皮下埋藏物及周圍組織病理檢查B組未經戊二醛處理的組織塊由于抗原性未被消除，引起局部組織明顯的變態性炎性反應，植入物周圍有較多的淋巴細胞、巨噬細胞及漿細胞浸潤，提示有明顯的炎癥反應發生，免疫組織化學檢測證實局部有IgG、IgM、C3沉著，移植物亦有變硬、攣縮及吸收；而A組與C組則鏡檢沒有明顯的淋巴細胞、巨噬細胞及漿細胞浸潤，免疫組織化學檢測證實局部沒有明顯的IgG、IgM、C3沉著，移植物亦沒有變硬、攣縮及吸收。結論 作為一種異種生物材料，新鮮牛頸靜脈帶瓣管道具有抗原性，本專利技術制備方法經戊二醛鞣制處理的牛頸靜脈帶瓣管道其抗原性幾乎完全消失，從而避免了異種移植免疫排斥反應的發生。本專利技術所述的制備方法經戊二醛復合鞣制的牛頸靜脈帶瓣管道去除了大量的可溶性蛋白、粘多糖和糖蛋白，漿膜層間的間質細胞已基本脫落，僅剩間質細胞下層，外結締組織層中成叢狀的脂肪細胞全部丟失；纖維層中膠原纖維及彈力纖維結構完整，排列整齊，呈不同方向的網狀排列，膠原纖維無溶解和斷裂現象，膠原蛋白分子間形成了牢固的交聯機構，從而掩蓋和封閉了蛋白分子中的活性基，使其失去抗原性。而且管道的組織斷裂強度及組織穩定性增加，盡管管道壁稍變硬、變厚，但仍富有彈性，固定后瓣葉無卷曲、變形，仍菲薄透明。戊二醛結合肝素對牛頸靜脈帶瓣管道進行處理，由于填充了內在膠原蛋白的空間，封閉了潛在鈣化點，改變電性，使宿主血漿鈣不能滲透到生本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種醫用牛頸靜脈帶瓣管道的制備方法：依次按以下步驟進行：（１）．自屠宰場采集當場宰殺的２－４歲健康牦牛，清潔狀況下取牛頸靜脈全段，用大量自來水沖洗靜脈腔內及外壁后，放置在盛有２～６℃生理鹽水的容器中帶回實驗室；（２）．即刻用手術刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪組織，然后用大量生理鹽水沖洗，直到洗去雜質和血醒味；（３）．浸泡于２～６℃Ｈａｎｋ’ｓ液內３～５小時，然后放入濃度為０．５～０．６５％戊二醛溶液中在瓣膜關閉狀態下固定４５～５５小時，溫度２２～２７℃；（４）．用蒸餾水沖洗，待上述浸泡溶液洗干凈以后，浸泡于濃度為１％肝素鹽水中２０～３０小時，溫度２２～２５℃；（５）．再用蒸餾水沖洗，洗去肝素鹽水液后，再浸泡在０．５％戊二醛中保存，送細菌及霉菌培養檢測證實無菌后，放入１℃～４℃冰箱保存備用。

【技術特征摘要】
1.一種醫用牛頸靜脈帶瓣管道的制備方法依次按以下步驟進行(1).自屠宰場采集當場宰殺的2-4歲健康牦牛，清潔狀況下取牛頸靜脈全段，用大量自來水沖洗靜脈腔內及外壁后，放置在盛有2～6℃生理鹽水的容器中帶回實驗室；(2).即刻用手術刀、剪，去除血管鞘及多余肌肉、脂肪組織，然后用大量生理鹽水沖洗，直到洗去雜質和血醒味；(3).浸泡于2～6℃Hank’s液內3～5小時，然后放入濃度為0.5～0.65％戊二醛溶液中在瓣膜關閉狀態下固定45～55小時，溫度22～27℃；(4).用蒸餾水沖...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何德沛，楊慶軍，申林，趙樹林，
申請(專利權)人：重慶市中山醫院，
類型：發明
國別省市：85[中國|重慶]