本發明專利技術涉及一種仔稚魚快速分類鑒定方法，其特征是采集調查水域中可以準確分類鑒定的魚類樣本，對各種魚類的線粒體16SrRNA片段分別進行PCR擴增、測序，并據此建立調查水域魚類DNA指紋庫，然后將經目測后無法從外觀形態加以區分的仔稚魚樣本編號后分別提取DNA，使用相同的方法對特征片段進行擴增、測序并與已建立的DNA指紋庫進行比對，從而快速判斷仔稚魚種類。本發明專利技術可以對處于早期發育階段、尚難以通過形態區分的仔稚魚進行快速分類鑒定，克服了以往目測誤差較大、需要大量培育待分類樣本的困難，體現了其快速、準確的優勢。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
魚類處于早期發育階段時形態和生理均會發生顯著變化，從而具有明顯的階段性特征，目前得到普遍認可的觀點為早期發育階段包含胚胎期、仔魚期及稚魚期，魚類早期資源調查即以處于這一階段的魚類個體為對象進行的資源調查工作。開展魚類早期資源調查，既能推算魚類繁殖群體數量，又可以估算補充群體數量，進而科學地預測魚類種群數量變動，為漁業資源保護和合理開發利用提供科學依據。國內的相關工作進展緩慢，現有的研究主要集中于魚類早期發育過程中的生理生態研究，關于仔稚魚區系組成、種群結構以及分布特征等資源層面的生態學研究開展較少。由于早期發育階段的魚類個體極小，各種外部形態尚未發生分化，個體間差異很難通過目測加以區分，因此樣本分類鑒定工作已經成分制約仔稚魚生態學研究發展的技術瓶頸。在以往的研究中，為了提高鑒定的準確性，通常采用先對苗種進行短期培育，待形態發生分化后再行鑒定的方法，但在苗種采集量較大、死亡率較高以及調查水域距離較遠時，常規方法具有明顯的局限性。
技術實現思路
本專利技術的目的即為克服常規方法的不足之處，提供。本專利技術為實現上述目的，采用如下技術方案，包括以下步驟(1)在調查水域采集可以準確分類鑒定的魚類樣本，提取樣本DNA，通過對特征片段進行擴增、測序，獲得相應序列，從而建立該水域魚類DNA指紋庫；(2)在調查水域采集仔稚魚樣本，提取樣本DNA，對特征片段進行PCR擴增、測序；(3)將獲得的仔稚魚特征片段序列與事先建立的DNA指紋庫進行比對，判斷仔稚魚種類。步驟(1)中所述DNA提取方法為取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20°C保存備用。所述的特征片段為線粒體16S rRNA。所述特征片段通用擴增引物為Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。所述的PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環94°C 1分鐘，57 °C 30秒，72 °C 1分鐘；共35個循環，最后72°C延伸8分鐘；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序。本專利技術在采集仔稚魚后僅需要用70%的酒精保存，不需要復雜的保存條件，同時選擇線粒體16S rRNA這一相對保守的片段為特征片段建立調查水域魚類DNA指紋庫，對仔3稚魚特征片段進行擴增、測序并將序列與DNA指紋庫進行比對的方法對調查水域仔稚魚進行分類鑒定。該方法鑒定準確度高，實驗周期短，對樣本要求低，克服了現有方法的局限性， 顯示了其準確、便捷、快速的優勢。具體實施例方式本專利技術為，采用以下步驟1、在調查水域通過定點捕撈、市場購買等方法獲取可以準確分類鑒定的魚類樣本，取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20°C保存備用；2、選擇相對保守的線粒體16SrRNA片段為特征片段，選擇通用擴增引物為；Reward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ；Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT ；3、PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環94°C1分鐘，57°C 30秒，72°C 1分鐘，共35個循環，最后72°C延伸8分鐘；4、PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序；5、將各魚類的線粒體16SrRNA片段序列匯總，建立DNA指紋庫；6、在調查水域采集仔稚魚樣本，保存于70%酒精中帶回實驗室，首先在顯微鏡或解剖鏡下觀察，將目測初篩后無法準確辨認的樣本編號，按步驟1所述的實驗程序分別提取DNA 并保存于_20°C冰箱中備用；7、對制備好的仔稚魚樣本DNA按步驟2-4所述的實驗程序，通過擴增、測序獲得各個樣本線粒體16S rRNA片段序列；8、將仔稚魚線粒體16SrRNA片段序列與已經建立的DNA指紋庫進行比對，并對仔稚魚樣本進行分類鑒定。權利要求1.，包括以下步驟(1)在調查水域采集可以準確分類鑒定的魚類樣本，提取樣本DNA，通過對特征片段進行擴增、測序，獲得相應序列，從而建立該水域魚類DNA指紋庫；(2)在調查水域采集仔稚魚樣本，提取樣本DNA，對特征片段進行PCR擴增、測序；(3)將獲得的仔稚魚特征片段序列與事先建立的DNA指紋庫進行比對，判斷仔稚魚種類。2.根據權利要求1所述的，其特征在于步驟(1)中所述DNA提取方法為取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提 DNA, _20°C保存備用。3.根據權利要求1所述的，其特征在于所述的特征片段為線粒體16S rRNA。4.根據權利要求1所述的，其特征在于所述特征片段通用擴增引物為Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。5.根據權利要求1所述的，其特征在于所述的PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環940C 1分鐘，57 °C 30秒，72 °C 1分鐘；共 35個循環，最后72°C延伸8分鐘；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序。全文摘要本專利技術涉及，其特征是采集調查水域中可以準確分類鑒定的魚類樣本，對各種魚類的線粒體16SrRNA片段分別進行PCR擴增、測序，并據此建立調查水域魚類DNA指紋庫，然后將經目測后無法從外觀形態加以區分的仔稚魚樣本編號后分別提取DNA，使用相同的方法對特征片段進行擴增、測序并與已建立的DNA指紋庫進行比對，從而快速判斷仔稚魚種類。本專利技術可以對處于早期發育階段、尚難以通過形態區分的仔稚魚進行快速分類鑒定，克服了以往目測誤差較大、需要大量培育待分類樣本的困難，體現了其快速、準確的優勢。文檔編號C12Q1/68GK102229997SQ20111014548公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日專利技術者劉凱, 周彥鋒, 張敏瑩, 徐東坡, 施煒綱, 段金榮 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種仔稚魚快速分類鑒定方法，包括以下步驟： （１）在調查水域采集可以準確分類鑒定的魚類樣本，提取樣本ＤＮＡ，通過對特 征片段進行擴增、測序，獲得相應序列，從而建立該水域魚類ＤＮＡ指紋庫； （２）在調查水域采集仔稚魚樣本，提取樣本ＤＮＡ，對特征片段進行ＰＣＲ擴增、測序； （３）將獲得的仔稚魚特征片段序列與事先建立的ＤＮＡ指紋庫進行比對，判斷仔稚魚種類。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉凱，施煒綱，張敏瑩，段金榮，周彥鋒，徐東坡，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，
類型：發明
國別省市：32
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