本發明專利技術所屬微生物餌料研究開發技術領域。本發明專利技術涉及餌料用高SOD活性海洋酵母的篩選方法。將海洋紅酵母菌接種于培養基上(葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂20g，鏈霉素300U/ml，陳海水1000ml，調pH值4.5-5.0，高壓滅菌20min，冷卻至室溫制成固體培養基)，20℃培養；挑取菌種于斜面上28℃活化三代后(每代24h)，挑取兩環培養物接種于裝有40ml液體培養基的150ml錐形瓶中，28℃搖床擴培24h；將擴培后活化菌種以10％接種量接種至百草枯濃度為0.25mmol/L的裝有40ml液體培養基的150ml錐形瓶中28℃、150r/min搖床培養3d，并將培養集中百草枯濃度由0.25mmol/L依次提高至0.3、0.35、0.4、0.45mmol/L，呂氏美藍染色進行死活鑒定，最終經涂布分離得單菌株；將分離得到的單菌落劃線接種至固體斜面培養，分別編號后，-20℃冰箱保藏。本發明專利技術可快速高效地定向篩選獲得高SOD活性的洋紅酵母以作為餌料用于養殖業。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術所屬微生物餌料研究開發
本專利技術涉及餌料用高SOD活性海洋酵母的篩選方法。本專利技術旨在快速高效地定向篩選獲得高SOD活性的海洋紅酵母以作為餌料用于養殖業。
技術介紹
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)可清除機體代謝產生的超氧陰離子，廣泛存在于生物體內。已有的研究表明，超氧化物歧化酶的活性與水產動物的免疫水平有密切關系，因而超氧化物歧化酶的活性常被用于判定水產養殖動物免疫性能的指標。酵母菌因其為真核動物，其細胞內所含超氧化物歧化酶與水產動物的超氧化酶相似，因而利用價值較大。賀華君等人將降解成多肽的無活性SOD和完整的SOD對ICR小鼠灌胃，發現降解后無活性的SOD能使紅細胞中SOD活性升高而口服完整的SOD可經胃腸吸收進入紅細胞而使其活性升高，這表明口服外源SOD對哺乳動物小鼠來說是有效的。因而，將高SOD活性的酵母應用于水產養殖以提高養殖動物的免疫能力在理論上是可行的。酵母菌菌體中富含蛋白質、維生素、生長因子等營養物質，適合性好。大部分酵母菌無毒，可以食用；并且可以利用工業廢料進行大量培養以生產單細胞蛋白。因而，酵母菌作為生物餌料已被廣泛應用于水產養殖業，特別是富含蝦青素的海洋紅酵母、紅發夫酵母在水產養殖中的作用越來越受到人們的重視。動物攝食富含蝦青素的紅酵母，紅發夫酵母可直接吸以酯化形式沉積于組織中，進而增加養殖動物的體色，提高觀賞動物的觀賞價值；還可增強水產動物對高氨和低氧的耐受性，清除自由基，抑制脂質過氧化，提高抗病能力。除此之外，超氧化物歧化酶在臨床醫藥、食品、化妝品及農業等方面均有應用。因而，開發高SOD活性的海洋紅酵母應用前景廣闊。百草枯在體內可產生超氧陰離子，進而誘導機體抗氧化基因的表達提高。但目前因內有關百草枯的報道僅限于研究其中毒機理，尚未見有關百草枯對微生物脅迫的報道； 國外，AdriermeT. Black等研究表明小鼠角質化表皮細胞在有百草枯的存在下Cu，Zn-SOD 表達量提高。Fang-Jenlee等研究表明在百草枯存在條件下，釀酒酵母SOD生物合成量顯著提高，但并未見有百草枯被用作篩選條件篩選高產SOD菌株的報道。鑒于目前高SOD活性的酵母菌的篩選大多是在大量的已有菌種中挑選SOD產量和生物量均較高的菌株，再用紫外線或EMS誘變，雖然這樣可以獲得高SOD的突變菌株，但是工作量大且由于突變的不確定方向性，很難將多個優良性狀集于同一菌株。本專利技術就是在已有的研究基礎上，經科學試驗后，首次創新性的提出通過逐步提高百草枯濃度淘汰抗氧化活性較低菌株進而實現定向篩選高SOD活性菌株的目的，以期應用于水產養殖業及工業發酵生產SOD。
技術實現思路
本專利技術涉及餌料用高SOD活性海洋酵母的篩選，其特征在于其篩選的方法包括以下過程 步驟(一)菌種自己分離或向菌種保藏單位及生物技術公司等索要或采購；步驟(二)培養基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂20g，鏈霉索300U/ mL,陳海水1000ml。調PH值4. 5-5. 0，高壓滅菌20min。冷卻至室溫制成固體培養基；步驟(三)菌種活化和篩選將海洋紅酵母菌接種于培養基上，20°C培養。挑取菌種于斜面上28°C活化三代后(每代24h)，挑取兩環培養物接種于裝有40mL液體培養基的150mL錐形瓶中，28°C搖床擴培24h ；步驟(四)將擴培后活化菌種以10%接種量接種至百草枯濃度為0. 25mmol/L的裝有40mL液體培養基的150mL錐形瓶中。28°C、150r/min搖床培養3d ；步驟(五)重復步驟四將培養集中百草枯濃度由0.25mmol/L依次提高至0.3、 0. 35,0. 4,0. 45mmol/L,呂氏美藍染色進行死活鑒定，最終經涂布分離得單菌株；步驟(六)菌種保藏將分離得到的單菌落劃線接種至固體斜面培養，分別編號后，-20°C冰箱保藏；步驟(七)將分離獲得的菌株發酵培養后以3000r/min離心15min后棄上清液， 再水洗兩遍，每次以3000r/min離心lOmin，棄上清，收集得濕菌體；步驟(八)檢測所分離菌株的SOD酶活性與初始菌株進行比較，發現所分離菌株的SOD酶活性顯著提高。具體實施例方式本專利技術所述的涉及餌料用高SOD活性海洋酵母的篩選方法包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本專利技術，但不以任何方式限制本專利技術。實施例步驟(一)菌種本實驗所用海洋紅酵母菌種購自大連健洋生物科技有限公司；步驟(二)培養基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂20g，鏈霉素300UmL， 陳海水1000ml。調PH值4. 5-5. 0，高壓滅菌20min。冷卻至室溫制成固體培養基；步驟(三)菌種活化和篩選將海洋紅酵母菌接種于培養基上，20°C培養。挑取菌種于斜面上28°C活化三代后(每代24h)，挑取兩環培養物接種于裝有40mL液體培養基的150mL錐形瓶中，28°C搖床擴培24h ；步驟(四)將擴培后活化菌種以10%接種量接種至百草枯濃度為0. 25mmol/L的裝有40mL液體培養基的150mL錐形瓶中。28°C、150r/min搖床培養3d ；步驟(五)重復步驟四將培養集中百草枯濃度由0.25mmol/L依次提高至0.3、 0. 35,0. 4,0. 45mmol/L,呂氏美藍染色進行死活鑒定，最終經涂布分離得單菌株；步驟(六)菌種保藏將分離得到的單菌落劃線接種至固體斜面培養，分別編號后，-20°C冰箱保藏；步驟(七)將分離獲得的菌株發酵培養后以3000r/min離心15min后棄上清液， 再水洗兩遍，每次以3000r/min離心lOmin，棄上清，收集得濕菌體；步驟(八)檢測所分離菌株的SOD酶活性與初始菌株進行比較，發現所分離菌株的SOD酶活性顯著提高。用百草枯篩選高SOD活性海洋紅酵母的有效性試驗1菌種與試劑菌種(大連健洋生物科技有限公司)、百草枯(四川西亞化工股份有限公司)、鄰苯三酚、異丙醇等均為分析純。2方法與結果 2. ISOD提取及酶活測定用異丙醇浸泡所收集得到的濕菌體(異丙醇體積與濕菌體質量之比為9 1)選擇性釋放S0D，抽濾除去溶劑，加入3倍體積的50mmol/LPH為7. 0的磷酸緩沖液中攪拌兩個小時，離心除去菌體即可得SOD釋放液。微量鄰苯三酚法檢測SOD酶活性。2.2S0D酶活性比較以初始菌株作對照，將所得菌株分別在不加百草枯和百草枯濃度為0. 075mmol/L 的培養基中培養72h后分別檢測各組SOD活性及蝦青素含量(每組3個平行，結果以M士SD 表示)，結果如下表表1百草枯處理對海洋紅酵母抗氧化性能的影響Table 1 The antioxidants of Rhodotorula marina treated with paraquatS μ召承 W _ ” 一ContrastTreatedTreated+paraquat生物量(干重/g)0.182+0.002 0.120土0.015α 04± λ0( 3 “ 一 BiomassSOD 比活(U/g)61.80±6.10 83.57±10.98126.87:1:13.90 SOD activitySOD 總量(U/40ml)23.16±2.77 17.08±2.1420.89±本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．本專利技術涉及餌料用高ＳＯＤ活性海洋酵母的篩選，其特征在于其篩選的方法包括以下過程：步驟（一）：菌種：自己分離或向菌種保臧單位及生物技術公司等索要或采購；步驟（二）：培養基：葡萄糖２０ｇ，蛋白胨１０ｇ，酵母膏５ｇ，瓊脂２０ｇ，鏈霉素３００Ｕ／ｍＬ，陳海水１０００ｍｌ。調ＰＨ值４．５－５．０，高壓滅菌２０ｍｉｎ。冷卻至室溫制成固體培養基；步驟（三）：菌種活化和篩選：將海洋紅酵母菌接種于培養基上，２０℃培養。挑取菌種于斜面上２８℃活化三代后（每代２４ｈ），挑取兩環培養物接種于裝有４０ｍＬ液體培養基的１５０ｍＬ錐形瓶中，２８℃搖床擴培２４ｈ；步驟（四）：將擴培后活化菌種以１０％接種量接種至百草枯濃度為０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的裝有４０ｍＬ液體培養基的１５０ｍＬ錐形瓶中。２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ搖床培養３ｄ；步驟（五）：重復步驟四將培養集中百草枯濃度由０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ依次提高至０．３、０．３５、０．４，０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ，呂氏美藍染色進行死活鑒定，最終經涂布分離得單菌株；步驟（六）：菌種保藏：將分離得到的單菌落劃線接種至固體斜面培養，分別編號后，－２０℃冰箱保臧；
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：關洪斌，王曉蘭，王洛洋，紀政，胡宗仁，王璐思，
申請(專利權)人：山東大學威海分校，
類型：發明
國別省市：37
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。