本發明專利技術公開了一種利用檸檬酸發酵液為原料發酵生產L-蘋果酸的方法，以檸檬酸發酵液為碳源，發酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發酵液，通過酶轉化的方法，使富馬酸鈉生成L-蘋果酸。經過20～26小時轉化，蘋果酸含量可達到78-85g/L，轉化率達到了81.2％～85.5％。本發明專利技術工藝簡單，能耗少，原料便宜，大大節約了生產成本。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用檸檬酸發酵液為原料發酵生產L-蘋果酸的方法。
技術介紹
L-蘋果酸是生物體糖代謝過程中產生的一種重要有機酸，廣泛存在于水果及蔬菜中，是一種優良的酸味劑和保鮮劑，主要運用于食品、化工、醫藥、日化及保健等，用其合成的尿素L-蘋果酸還可用于非線性光學有機材料。近年來，L-蘋果酸市場逐漸啟動，需要快速增加，已呈現嚴重供不應求的局面。由于用天然產物提取或者化學合成的來生產蘋果酸的方法成本過高，因此用微生物的方法合成L-蘋果酸是今后大規模生產的趨勢。目前用微生物合成L-蘋果酸的菌種繁多，但大致可以分為四類1.由絲狀菌和酵母菌發酵，由多糖降解成L-蘋果酸。2.培養細菌，由菌體內的延胡索酸酶將加入的延胡索酸轉化成L-蘋果酸3.將含延胡索酸的菌體細胞固定化，或從細胞中提取出延胡索酸酶制成固定化酶之后，再將延胡索酸轉化成L-蘋果酸。4.先培養根酶將葡萄糖降解成延胡索酸，再接入普通變形桿菌混合培養，將延胡索酸轉化成L-蘋果酸。其中，第2種方法是目前用于L-蘋果酸生產的主要方法。但由于延胡索酸酶的制備培養基通常以檸檬酸為碳源，而成品檸檬酸的價格較高，從而導致生產成本較高。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術提供一種利用檸檬酸發酵液為原料發酵生產L-蘋果酸的方法。本專利技術提供的發酵生產L-蘋果酸的方法，其為以檸檬酸發酵液為碳源，發酵產延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發酵液轉化富馬酸鈉生成蘋果酸。其中，所述的發酵產延胡索酸酶菌株的培養基為檸檬酸發酵液20 25wt%、 MgSO4O. 02 0. 05wt%、玉米菜 3. 5 4. 5wt%,KH2PO4O. 2 0. 4wt%,NH3 ·Η20 3 5wt%。其中，所述的檸檬酸發酵液中檸檬酸的質量分數為10 15%。其中，可通過本領域公知的方法發酵黑曲霉，獲得檸檬酸發酵液。優選可參看 CN101638675的方法發酵產程檸檬酸發酵液。根據本專利技術，優選當延胡索酸酶的酶活力為21000 M000 μ mol/g·!!時，停止發酵產延胡索酸酶菌株。其中，優選的發酵溫度為；34 36°C，發酵時間為20 40h。根據本專利技術，在產延胡索酸酶菌株發酵過程中，優選的發酵液體積和無菌空氣的通氣量之比為1 0. 5-0. 9。根據本專利技術，可選用任何本領域公知的可發酵產生延胡索酸酶的菌株，可選自溫特曲霉、產氨短桿菌、普通變形桿菌、黃色短桿菌或其組合，優選的菌株為產氨短桿菌菌株M13(保藏號為 CICC 10169)。根據本專利技術，將含有延胡索酸酶的發酵液轉化富馬酸鈉，生成L-蘋果酸，其中含有延胡索酸酶的發酵液和富馬酸鈉的混合液中延胡索酸酶酶活為10500 13333 μ mol/ g · h，富馬酸鈉的濃度為0. 44 0. 83mol/L。根據本專利技術，優選的轉化L-蘋果酸的溫度為37_40°C，轉化時間為20_26小時。本專利技術針對延胡索酸酶發酵培養基中添加的成品檸檬酸價格較高的問題，采用按一定比例的檸檬酸發酵液來代替成品檸檬酸的添加，使得生產成本最低化，并建立了相應的檸檬酸發酵液預處理辦法與酶發酵生產代謝控制技術；本專利技術利用檸檬酸發酵液為碳源，對其他培養基成分也進行了優化，并且對酶發酵過程和酶轉化工藝也做出了相應的改進，最后得到的較高的L-蘋果酸產量和轉化率，對與L-蘋果酸的大規模生產具有重要的現眉、ο具體實施方法以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1按照CN101638675公開的方法，發酵黑曲霉獲得檸檬酸發酵液，發酵液中檸檬酸的含量為12%，將其經板框過濾器進行壓濾，除去發酵液中的菌絲等固態雜質后，收集發酵液。實施例2先將延胡索酸酶生產菌株產氨短桿菌Μ13(保藏號為CICC10169)(購自中國工業微生物菌種保藏管理中心)在通風條件下培養40小時，以的接種量接種到IOm2發酵罐中進行發酵，發酵溫度控制在36°C，初始ρΗ為7. 3。其中，所述的發酵培養基為實施例 1 制備的檸檬酸發酵液 20wt %, MgSO4O. 02wt%、玉米漿 3. 5wt%, KH2PO4O. 2wt%, NH3 · H2O 3wt%。經發酵30小時后，當產氨短桿菌OD66tlnm達到0. 48，生產得到的延胡索酸酶酶活為 22311 4!1101/^*11時結束發酵，之后將酶發酵液和1.411101/1的富馬酸納溶液按照1 0.8 的體積比混合加入生物反應結晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進行酶反應，經過 24小時轉化，使L-蘋果酸含量達到81g/L，轉化率達到了 82.2%。實施例3先將延胡索酸酶生產菌株產氨短桿菌M13在通風條件下培養40小時，以1 %的接種量接種到50m2發酵罐中進行發酵，發酵溫度控制在36°C，初始pH為7. 5。其中，所述的發酵培養基為實施例1制備的檸檬酸發酵液25wt%、MgSO4O. 05wt%、玉米漿4. 5wt%, KH2PO4O. 4wt %、NH3 · H2O 5wt %。經發酵28小時后，當產氨短桿菌OD66tlnm達到0. 51，生產得到的延胡索酸酶酶活為 23712 μ mol/g · h時結束發酵，之后將酶發酵液和1. 5mol/L的富馬酸納溶液按照1 1的體積比混合加入生物反應結晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進行酶反應，經過M 小時轉化，使L-蘋果酸含量達到83g/L，轉化率達到了 83. 9 %。實施例4先將延胡索酸酶生產菌株產氨短桿菌M13在通風條件下培養40小時，以的接種量接種到80m2發酵罐中進行發酵，發酵溫度控制在36°C，初始pH為7. 5。其中，所述的發酵培養基為實施例1制備的檸檬酸發酵液22wt%、MgSO4O. (Mwt %、玉米漿4. Owt KH2PO4O. 3wt %、NH3 · H2O 4wt %。經發酵33小時后，當產氨短桿菌OD66tlnm達到0. 47，生產得到的延胡索酸酶酶活為 21890 μ mol/g · h時結束發酵，之后將酶發酵液和lmol/L的富馬酸納溶液按照1 0. 8的體積比混合加入生物反應結晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進行酶反應，經過25 小時轉化，使L-蘋果酸含量達到79. 5g/L，轉化率達到了 81. 3%。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本專利技術作了詳盡的描述，但在本專利技術基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本專利技術精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本專利技術要求保護的范圍。權利要求1.一種利用檸檬酸發酵液為原料發酵生產L-蘋果酸的方法，其特征在于，以檸檬酸發酵液為碳源，發酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發酵液，通過酶轉化的方法，使富馬酸鈉生成L-蘋果酸。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發酵產延胡索酸酶菌株的培養基為檸檬酸發酵液 20 25wt%、MgS040. 02 0. 05wt %、玉米漿 3. 5 4. 5wt%、ΚΗ2Ρ040. 2 0. 4wt%,NH3 · H203 5wt%，pH 為 7· 2 7· 5。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的檸檬酸發酵液中檸檬本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種利用檸檬酸發酵液為原料發酵生產Ｌ－蘋果酸的方法，其特征在于，以檸檬酸發酵液為碳源，發酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發酵液，通過酶轉化的方法，使富馬酸鈉生成Ｌ－蘋果酸。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮杰，穆曉玲，李維理，唐浩，
申請(專利權)人：安徽豐原發酵技術工程研究有限公司，
類型：發明
國別省市：34
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