一種用復合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法技術

本發明專利技術公開了一種用復合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法。該方法是將牡蠣去殼，搗碎，加蒸餾水，勻漿，酶解，滅酶，調節pH值，真空減壓抽濾及冷凍干燥后，獲得一種分子量小于3000Da的活性肽。本發明專利技術制備出的牡蠣活性多肽純度高，能降低抗體免疫反應，是一種潛在的免疫抑制劑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種牡蠣活性肽的制備方法，特別是，屬于海洋天然產物與醫藥

技術介紹
牡蠣(Oyster)是一種海產貝類。牡蠣在分類上屬于軟體動物門，瓣鰓綱，異柱目，牡蠣超科，牡蠣科，它是一種食藥兩用的雙殼貝海產品。在我國南北沿海均有養殖，特別是廣東省近幾年來發展較快，牡蠣肉質乳白、細嫩、營養豐富，除含有豐富的蛋白質、維生素和糖類外，還含有人體必需的十多種氨基酸、礦物質營養成分等。近代研究表明牡蠣含18種氨基酸、肝糖元、B族維生素、牛磺酸和鈣、磷、鐵、鋅等營養成分，常吃可以提高機體免疫力，其所含牛磺酸可降血脂、降血壓。臨床上，牡蠣在治療失眠、慢性中耳炎、小兒多汗癥、子宮肌瘤以及小兒遺尿等方面均有突出的療效(中醫藥信息，2011，28 (I) : 114-116.)。牡蠣提取物有抗菌作用，對脊髓灰質炎病毒和流感病毒有抑制作用，其水溶性成分尚可提高動物機體免疫力等等。從牡蠣中提取活性物質的研究過去有報道，并且具有顯著醫療保健作用的牡蠣保健食品已經有銷售。如深圳海王集團在牡蠣相關產品的開發研究中，已經取得了顯著的經濟效益和社會效益，為進一步推動該項目的產業化發展，正在努力研發高效的牡蠣保健食品和藥品。目前，活性肽的主要生產方法通過酶法制備。中國專利公開號CN 1680578A公開了一種牡蠣活性肽的制備方法，以太平洋牡蠣為原料，利用蛋白酶水解牡蠣蛋白，再用納濾技術脫鹽濃縮，可得到牡蠣活性肽。該方法中使用的為蛋白酶，而酶的選擇是生產活性肽的關鍵，酶的水解能力具有專一性，若想獲得具有獨特活性的多肽，單用一種酶效果不佳。且該方法屬于食品生物
，并未涉及到醫藥領域。從海洋動植物中篩選抗免疫調節促進劑、免疫調節抑制劑、促進或抑制血管形成、抗腫瘤作用等活性物質是藥物研發的一個重要領域，但有關從海洋生物活性肽篩選具有免疫調節作用研究仍未得到足夠重視。中國專利公開號CN 101037468A公開了一種牡蠣活性肽的制備方法，以牡蠣為原料，利用酶法水解牡蠣蛋白及利用柱層析技術分離純化獲得高純度的牡蠣活性多肽，該法所得到的牡蠣活性多肽雖然可以作為藥品成分加以開發利用，但因其成本昂貴，難以實現大量生產。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對上述方法提出的不足，提供了一種能實現規模化生產免疫活性肽的方法。為了解決上述技術問題，本專利技術是通過以下技術方案實現的，按照以下步驟制備1.將牡蠣去殼，搗碎，按照 1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；2.向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量O. 5-2. 0%。的植物蛋白水解復合酶，在40_60°C下進行酶解反應3-5h ；3.將酶解反應完成后的牡蠣漿液置于90-100°C下滅酶10-15min。4.酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調節pH值至3-5 ；5.牡蠣漿液調節pH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫色時間35min。6.將脫色后的牡蠣漿液用MWC03000超濾膜，在真空減壓下抽濾，得到濾液。7.將濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于3000Da,蛋白質含量為85. 2%,氮含量為12. 7%的牡蠣蛋白多肽。所述酶解反應所用酶為南寧龐博生物工程有限公司的專利技術專利植物蛋白水解復合酶，它包含有內切酶和外切酶、風味酶。內切酶在木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶中選用，或者選用這些內切酶的混合物。其制備方法為以木瓜蛋白酶制備為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質沉淀，離心、過濾，經微濾和超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、密封保存備用；菠蘿蛋白酶也按照此方法制備；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶的制備，用已知方法經發酵提取得到；外切酶在米曲霉或米根霉、黑曲霉等發酵物提取中選用，或者選用這些外切酶的混合物。其制備方法為以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30-50 V，濕度70-90 %的密閉容器中發酵2-5天，提取、再干燥，密封保存備用。風味酶在乳酸菌或酵母菌等發酵物提取中選用，或者選用這些風味酶的混合物。其制備方法為以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發酵1-4天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風味酶，保存備用。優選的酶解反應溫度為60°C，反應時間為4h。優選的滅酶溫度為95°C，時間為lOmin。優選將滅酶后的牡蠣漿液調節pH值至4. 5。所述活性炭溶液的制備方法是將活性炭預熱200°C，活化lh，用蒸餾水將所得沉淀配成質量濃度為5%的溶液。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是1.本專利技術采用南寧龐博生物工程有限公司的專利技術專利植物蛋白水解復合酶，可制備優質的具有獨特活性的多肽。2.本專利技術利用超濾膜進行活性肽的篩分，通過膜的選擇性，以膜兩側存在的一定量能量差作為推動力，溶液中各組分透過膜的遷移速率的不同而實現非均相物系的分離。由于超濾膜具有不對稱微孔結構，且采用薄層流道和湍流促進結構，減少膜的污染，在分離過程中，使得大分子溶質和微粒(如膠體或淀粉等)隨溶液切向流經膜表面，而小分子物質和溶劑則在壓力驅動下穿過致密層上的微孔而進入膜的另一側，因而超濾膜可以長期連續使用并保持較恒定的產量和分離效果。與傳統工藝相比較，不僅可以提高產品的純度、節約溶劑或試劑的耗用量，環境污染小，能夠實現連續化分離純化，縮短生產周期，可實現大規模產業化生產。3.本專利技術產品牡蠣活性多肽可抑制小鼠淋巴細胞和人T細胞白血病細胞Jurkat細胞增殖能力，即能降低抗體免疫反應，是一種潛在的免疫抑制劑。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式并不局限于實施例表示的范圍(其中復合酶以南寧龐博生物工程有限公司的專利技術專利植物蛋白水解復合酶的部分實施例為原料)。 實施例1 :內切酶的制備以木瓜蛋白酶制備為例，從木瓜樹或果實取下新鮮木瓜漿，先用蒸餾水或去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無機酸使雜質沉淀，離心、過濾，經微濾與超濾、濃縮、真空冷凍干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存備用。外切酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，濕度90%的密閉容器中發酵3天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存備用。風味酶的制備以大豆或豆柏、麥鼓為原料，按常規的方法，將大豆或豆柏、麥鼓粉碎，先滅菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌種，在常溫下發酵2天，提取、分離、超濾等方法取得溶液，然后凍干，粉碎得到風味酶，保存備用。將上述的內切酶、外切酶、風味酶按質量份數64 30 5的比例，并加入I份焦亞硫酸鈉，混合，得到植物蛋白水解復合酶，置于10°c的冰箱保存。將牡蠣去殼，搗碎，按照1:1的重量比例加入蒸餾水，在室溫下勻漿，得到牡蠣漿液；向牡蠣漿液加入牡蠣蛋白重量O. 5%%。的植物蛋白水解復合酶，在40°C下進行酶解反應3h ;將酶解反應完成后的牡蠣漿液置于90°C下滅酶IOmin ;采用甲醛滴定法測定氨基氮總量，凱氏定氮法測定總氮；酶滅活后的牡蠣漿液保持70°C，加入鹽酸調節pH值至3 ；牡蠣漿液調節PH值后，加入活性炭溶液進行脫色，脫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種用復合酶水解牡蠣蛋白制備活性肽的方法，其特征是，按照以下步驟制備：①將牡蠣去殼、搗碎，按照１∶１的重量比例加入蒸餾水，勻漿，得到牡蠣漿液；②將牡蠣漿液進行酶解反應，所述酶解反應所用酶為植物蛋白水解復合酶；③酶解反應結束后給牡蠣漿液滅酶；④滅酶后的牡蠣漿液用鹽酸調節ｐＨ值；⑤將調節ｐＨ值后的牡蠣漿液進行脫色；⑥將脫色后的牡蠣漿液用抽濾膜進行抽濾，得到濾液；⑦將所得濾液冷凍干燥，即可獲得分子量小于３０００Ｄａ的牡蠣蛋白多肽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳艷輝，李超柱，黎丹戎，
申請(專利權)人：欽州學院，
類型：發明
國別省市：45