單個(gè)生物分子反應(yīng)實(shí)時(shí)原位表征方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種單個(gè)生物分子反應(yīng)實(shí)時(shí)原位表征方法。該方法包括如下步驟：將反應(yīng)物I固定于DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，然后對(duì)修飾有反應(yīng)物I的DNA折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像，之后加入與所述反應(yīng)物I對(duì)應(yīng)結(jié)合的反應(yīng)物II，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。該方法能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，準(zhǔn)確記錄描述單個(gè)分子反應(yīng)過(guò)程，并有利于研究界面上單分子反應(yīng)動(dòng)態(tài)過(guò)程。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種。
技術(shù)介紹
到目前為止，大多數(shù)單分子研究依然采用光學(xué)顯微鏡的方法，其標(biāo)記步驟不可避免，而熒光壽命也是必須考慮的問(wèn)題。同時(shí)，針對(duì)單分子研究的特點(diǎn)還需要對(duì)檢測(cè)體系中的某些組分固定、對(duì)捕獲分子、檢測(cè)分子等進(jìn)行細(xì)致的調(diào)節(jié)，以獲取高的信噪比；另外，困擾檢測(cè)的非特異性吸附也是必須特別考慮的。而另一方面，基于原子力顯微鏡(AFM)的力譜方法可對(duì)分子間的相互作用力給出定量的描述，精度可達(dá)到PN量級(jí)，是研究單分子的重要方法之一；但是，檢測(cè)速度相對(duì)較慢，通量低。最近發(fā)展起來(lái)的快速掃描AFM在單分子成像研究獲得了很大的進(jìn)展，可實(shí)時(shí)記錄蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為研究生物單分子行為及其機(jī)理提供了非常有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；但是，對(duì)于蛋白質(zhì)構(gòu)型變化不夠顯著，如小于1納米的構(gòu)型變化，就比較困難了。DNA折紙術(shù)是最近幾年得到迅猛發(fā)展的納米技術(shù)，利用一條單鏈DNA(通常為 M13mpl8)與相配對(duì)的200多條寡核苷酸鏈自組裝而成。一般通過(guò)設(shè)計(jì)不同的寡核苷酸鏈， 可使DNA組裝成不同的結(jié)構(gòu)；同時(shí)由于寡核苷酸鏈末端可被多種分子修飾，所以具有圖案可控和編碼可循的特征，具有反應(yīng)位點(diǎn)精確可控的優(yōu)勢(shì)；而AFM具有納米級(jí)的分辨率，通過(guò)檢測(cè)折紙上特定位置的形貌變化就能夠準(zhǔn)確判斷反應(yīng)變化的情況，如反應(yīng)是否發(fā)生，以及反應(yīng)速度快慢等。但是，現(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有一種能夠針對(duì)單個(gè)生物分子反應(yīng)的實(shí)時(shí)原位成像方法， 該現(xiàn)狀亟待解決。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于單個(gè)生物分子反應(yīng)實(shí)施動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)原位納米尺度成像方法存在空白的缺陷，提供了一種能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，準(zhǔn)確記錄描述單個(gè)分子反應(yīng)過(guò)程，并便利研究界面上單分子反應(yīng)動(dòng)態(tài)過(guò)程的。本專利技術(shù)的包括如下步驟將反應(yīng)物I固定于 DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，然后對(duì)修飾有反應(yīng)物I的DNA折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像，之后加入與所述反應(yīng)物I對(duì)應(yīng)結(jié)合的反應(yīng)物II，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。本專利技術(shù)中，所述的反應(yīng)物I、反應(yīng)物II為本領(lǐng)域常規(guī)所述的生物單分子之間可反應(yīng)結(jié)合的一對(duì)物質(zhì)，如抗原-抗體反應(yīng)，DNA-蛋白質(zhì)反應(yīng)，較佳的為生物素-親和素系統(tǒng)、 或凝血酶-適配體反應(yīng)系統(tǒng)。本專利技術(shù)中，所述的反應(yīng)物I固定于DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)的方式為本領(lǐng)域常規(guī)操作條件進(jìn)行選擇，一般為修飾于DNA折紙上(也稱反應(yīng)物I修飾的DNA折紙)。所述的DNA折紙、及其反應(yīng)物I固定位點(diǎn)的設(shè)計(jì)均可為本領(lǐng)域常規(guī)操作方式設(shè)計(jì)。本專利技術(shù)的單個(gè)生物分子反應(yīng)原位表征方法較佳的為包括如下步驟將生物素固定于DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，對(duì)修飾有生物素的DNA折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像，之后加入鏈霉親和素，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。其中，所述的生物素為本領(lǐng)域常規(guī)所述，小分子、分子量對(duì)4;所述的親和素本領(lǐng)域常規(guī)所述，分子量為65kD，理論值大小為5nmX4nmX4nm。其中，所述的DNA折紙為本領(lǐng)域常規(guī)所述。所述的DNA折紙的圖案可根據(jù)需要設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)中較佳的為IOOnmX 70nm長(zhǎng)方形圖案。所述的DNA折紙按本領(lǐng)域常規(guī)，一般由腳手架鏈M13mpl8 DNA和訂書(shū)釘單鏈自組裝形成，訂書(shū)釘單鏈用于固定腳手架鏈形成目標(biāo)圖形。其中，所述的生物素固定的DNA折紙的設(shè)計(jì)位點(diǎn)一般按DNA折紙的圖案形狀設(shè)計(jì)， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可按本領(lǐng)域常規(guī)操作具體進(jìn)行，一般在DNA折紙制備時(shí)將目標(biāo)設(shè)計(jì)位點(diǎn)的訂書(shū)釘單鏈替換為生物素修飾的訂書(shū)釘單鏈即可。所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA、訂書(shū)釘單鏈(未修飾生物素)和生物素修飾的訂書(shū)釘單鏈均市售可得，例如，腳手架鏈M13mpl8 DNA(N4040S)可購(gòu)自NEB公司、訂書(shū)釘單鏈和生物素修飾的訂書(shū)釘單鏈可購(gòu)自上海生工公司ο其中，所述的生物素固定于DNA折紙的制備按本領(lǐng)域常規(guī)操作，一般于IXTAE/ Mg2+緩沖液中進(jìn)行。所述的1 XTAE/Mg2+緩沖液一般包括如下組分Tris 40mM,乙酸20mM， EDTA 2mM, MgCl212. 5mM,且pH值為8。所述的生物素固定于DNA折紙的制備方法較佳的包括如下步驟將腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書(shū)釘單鏈(包括訂書(shū)釘單鏈和生物素修飾的訂書(shū)釘單鏈)混合后置于1 XTAE/Mg2+緩沖液體系，再置于PCR儀(Eppendorf Mastercycler Personal machine)上從95°C退火至20°C即可，其中退火速度為0. 1°C/10s。所述的有生物素的DNA折紙制備后一般于4°C保存。所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書(shū)釘單鏈較佳的按摩爾比1 10 1 5混合，更佳的為1 10。其中，所述的原子力顯微鏡為本領(lǐng)域常規(guī)所述，例如NANC^cope IIIa系統(tǒng) (Digital htrument，美國(guó))、或者V型系統(tǒng)均可。所述的原子力顯微鏡掃描頭、原子力顯微鏡(AFM)探針均為本領(lǐng)域常規(guī)，例如原子力顯微鏡掃描頭為J型掃描頭、AFM探針為NP-S 氮化硅針尖(彈性系數(shù)0. 58ΝΠΓ1，Veeco公司)。其中，所述的原子力顯微鏡成像為本領(lǐng)域常規(guī)操作，一般為將修飾有生物素的DNA 折紙溶液滴加于云母片上吸附，之后置于原子力顯微鏡下，于液相輕敲模式進(jìn)行成像操作。其中，所述的原子力顯微鏡成像的條件為本領(lǐng)域常規(guī)，一般影響不大，較佳的為溫 25 C ο其中，所述的原子力顯微鏡成像的各種溶液均按按本領(lǐng)域常規(guī)脫氣處理。其中，所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的濃度較佳的為3. 2nM 1. 6nM，更佳的為1. 6nM。其中，所述的修飾有生物素的DNA折紙溶液的用量為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的為大于0 且彡5 μ L，更佳的為2 μ L。其中，所述的吸附的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的為aiiin 5min，更佳的為5min。其中，所述的原子力顯微鏡成像的云母襯底按本領(lǐng)域常規(guī)，一般為新解離的云母片。使用時(shí)，云母片粘于鐵片上，之后即可置于原子力顯微鏡載樣臺(tái)上進(jìn)行AFM成像。其中，所述的成像操作為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的為將ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液注入固定好的液體槽中進(jìn)行成像操作。所述的1 XTAE/Mg2+緩沖液的用量較佳的為30uL 50uL，更佳的為50yL。其中，所述的液體槽為本領(lǐng)域常規(guī)使用，較佳的為配有細(xì)口徑導(dǎo)管的兩孔的液體槽。液體槽一般在使用時(shí)固定于載有樣品的云母片上方，之后注入成像時(shí)的各種溶液隨后即可進(jìn)行成像操作。其中，所述的鏈霉親和素(str印tavidin，SA)溶液的濃度較佳的為7. 6nM 76nM。 所述的鏈霉親和素溶液的用量較佳的為30uL 50uL，更佳的為50uL。所述的鏈霉親和素溶液在成像過(guò)程中加入較佳為待吸附修飾有生物素的DNA折紙的云母片成像穩(wěn)定后加入。 所述的鏈霉親和素溶液加入速度較佳的為以不影響成像為準(zhǔn)。所述的鏈霉親和素溶液加入時(shí)，較佳的將液體槽的大孔堵住。所述的鏈霉親和素市售可得，如可購(gòu)自上海生工公司。其中，所述的原子力顯微鏡成像模式為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的為AFM輕敲模式。所述的原子力顯微鏡成像使用力較佳的為最小力成像。其中，所述的原子力顯微鏡成像參數(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳的為掃描速率2Hz，驅(qū)動(dòng)振幅400mV,電壓0. 3V，掃描數(shù)256。本專利技術(shù)中所用原料和試劑均市售可得。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，本專利技術(shù)中上述的各技術(shù)特征優(yōu)選條件可以任意組合得到較佳實(shí)例。本專利技術(shù)的積極進(jìn)步效果本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種單個(gè)生物分子反應(yīng)實(shí)時(shí)原位表征方法，其特征在于：其包括如下步驟：將反應(yīng)物Ｉ固定于ＤＮＡ折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，然后對(duì)修飾有反應(yīng)物Ｉ的ＤＮＡ折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像，之后加入與所述反應(yīng)物Ｉ對(duì)應(yīng)結(jié)合的反應(yīng)物ＩＩ，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種單個(gè)生物分子反應(yīng)實(shí)時(shí)原位表征方法，其特征在于其包括如下步驟將反應(yīng)物I固定于DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，然后對(duì)修飾有反應(yīng)物I的DNA折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像， 之后加入與所述反應(yīng)物I對(duì)應(yīng)結(jié)合的反應(yīng)物II，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的反應(yīng)物I和反應(yīng)物II為生物素-親和素系統(tǒng)或凝血酶-適配體反應(yīng)系統(tǒng)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟將生物素固定于 DNA折紙?jiān)O(shè)計(jì)位點(diǎn)，對(duì)修飾有生物素的DNA折紙進(jìn)行原子力顯微鏡成像，之后加入鏈霉親和素，并持續(xù)掃描成像收集數(shù)據(jù)即可。4.如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的DNA折紙為IOOnmX70nm 長(zhǎng)方形圖案，由腳手架鏈M13mpl8 DNA和訂書(shū)釘單鏈自組裝形成，訂書(shū)釘單鏈用于固定腳手架鏈形成目標(biāo)圖形。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的生物素固定于DNA折紙的制備于 ΙΧΤΑΕ/Mg2+緩沖液中進(jìn)行；所述的生物素固定于DNA折紙的制備方法包括如下步驟將腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書(shū)釘單鏈混合后置于1 X TAE/Mg2+緩沖液體系，再置于PCR儀上從 95°C退火至20°C即可，其中退火速度為0. I0C /IOs ；其中，所述的腳手架鏈M13mpl8 DNA與訂書(shū)釘單鏈按摩爾比1 10 1 5混合，較佳的為1 10。6...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳娜，李賓，胡鈞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：31