本發(fā)明專利技術(shù)的技術(shù)方案是：一種豬圓環(huán)病毒II型核酸疫苗，在真核表達(dá)載體pIRES的2個多克隆位點中分別插入了豬圓環(huán)病毒II型LY株ORF2和豬IL-18基因，所述核酸疫苗共表達(dá)豬圓環(huán)病毒II型LY株Cap和豬IL-18蛋白。本發(fā)明專利技術(shù)經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功構(gòu)建了共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-ORF2/PIL18。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pIRES-ORF2/PIL18用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染豬腎PK-15細(xì)胞，以RT-PCR和間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)RT-PCR檢測到兩種目的基因的轉(zhuǎn)錄；間接免疫熒光試驗檢測到ORF2蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中觀察到了特異性的亮綠色熒光，證明蛋白得到表達(dá)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種核酸疫苗，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒Ii型核酸疫苗及其制備方法。
技術(shù)介紹
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒，有豬圓環(huán)病毒I型(PCVl)和豬圓環(huán)病毒II型(PCM)兩種基因型。豬是PCV2的易感動物，各種年齡、不同性別的豬都可以感染PCV2。常見的仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征 (Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)主要發(fā)生在哺乳期和育成期的仔豬，尤其是5 12周齡的仔豬，一般于斷奶后2 3天開始發(fā)病。從發(fā)病的季節(jié)來看，一年四季均可發(fā)病，但高峰期在五月，其次是四月和六月。發(fā)病日齡隨著地區(qū)的不同也存在著差異，這與獨(dú)特的誘發(fā)因素、母源抗體的水平以及它的下降速度不同都有一定的關(guān)系。在疾病感染流行過程中發(fā)病率和死亡率都較低，急性發(fā)病豬群中的死亡率可達(dá)10%，在感染PCV2 的豬群中常常由于并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染而死亡率大大增加。PCV2具有致病性，是 PMWS的主要病原，PMWS呈世界性分布，是困擾養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病。PCV2感染后導(dǎo)致豬體的免疫抑制，從而引起繼發(fā)感染，進(jìn)一步加重PCV2病情，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，PCV2及其所致的相關(guān)疾病引起了獸醫(yī)界的高度重視，成為當(dāng)前研究的熱點。PCV2為無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。該病毒無囊膜，病毒粒子直徑為14 25nm，基因組大小為1767bp或1768bp，0RFl和0RF2是最主要的讀碼框。0RF2大小為702bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白)， 具有良好的免疫原，產(chǎn)生的抗體在血清中維持時間長，是構(gòu)建重組疫苗和檢測的首選基因。 Liu等用大腸埃希氏菌表達(dá)了 0RF2融合蛋白，并證明該表達(dá)產(chǎn)物具有很強(qiáng)的免疫原性。目前在生產(chǎn)中通常采用加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、減少應(yīng)激、做好其他疫病的預(yù)防等措施來控制該病的發(fā)生和流行。由于PCV2在體外細(xì)胞上增殖滴度不高，毒價測定須借助免疫過氧化物酶單層試驗等，因此用全病毒來制備滅活疫苗或弱毒疫苗操作繁瑣，成本高。而基因工程疫苗如DNA疫苗、亞單位疫苗及病毒活載體疫苗等將是研制PCV2疫苗的主要方向。DNA 疫苗作為第3代疫苗，因其既有亞單位疫苗的安全性，又有減毒活疫苗的有效性而受到研究人員的重視，它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和保護(hù)性免疫應(yīng)答。研究人員對PCV2DNA疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，單一抗原的DNA疫苗攻毒保護(hù)力較低。許多研究表明，細(xì)胞因子能夠增強(qiáng)機(jī)體對抗原的反應(yīng)性或增強(qiáng)抗原的免疫原性。 白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子，它可刺激 ι 細(xì)胞高水平誘生IFN- y、GM-CSF, IL-2等細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖， 顯著增強(qiáng)Thl細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等免疫調(diào)節(jié)功能。Mimeta等于1999年首次成功克隆出了豬IL-18基因并對其序列進(jìn)行了初步研究(Muneta Y，Mori Y，Shimoji Y，et al.Porcine interleukinl8 :cloning, characterization of the cDNA and expression with the baculovirus system. Cytokine,2000,12(6) :566-572.)。豬 IL—18(pIL—18)3是目前研究較多的細(xì)胞因子佐劑，其良好的免疫增強(qiáng)作用在一些基因疫苗的研究中得到證實。早在DNA疫苗產(chǎn)生以前就有人把細(xì)胞因子作為佐劑與疫苗聯(lián)用，但由于細(xì)胞因子在體內(nèi)半衰期太短且造價昂貴，未能在傳統(tǒng)疫苗中廣泛應(yīng)用。直接利用大腸桿菌表達(dá)的重組豬IL-18作佐劑，也仍有較大困難。一是由于大腸桿菌為原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白存在非糖基化形式和非天然狀態(tài)折疊等缺陷，這使得表達(dá)的蛋白分子失去天然結(jié)構(gòu)，因而對重組蛋白的活性還存在爭議；二是要使豬IL-18發(fā)揮佐劑效應(yīng)，就必須使它到達(dá)抗原應(yīng)答部位，而體外表達(dá)的重組豬IL-18被機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位是極其困難的。真核表達(dá)系統(tǒng)則對重組蛋白可進(jìn)行糖基化、折疊等修飾作用，重組蛋白在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性等方面更接近于天然蛋白，所以真核表達(dá)系統(tǒng)在研究中也被廣泛使用。DNA疫苗作為第3代疫苗，由于其有著其它疫苗無可比擬的優(yōu)越性，引起了醫(yī)學(xué)和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)界的極大興趣。首先DNA疫苗的抗原合成、提呈過程與病原的自然感染極為相似，抗原經(jīng)內(nèi)源性合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，經(jīng)MHC-I類和MHC-II類分子直接提呈給免疫細(xì)胞，從而誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，特別是特異性CD+8細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)的免疫反應(yīng)，這對于主要依賴細(xì)胞免疫機(jī)制形成免疫保護(hù)的病原感染的防治極有意義。這是滅活疫苗和一般亞單位疫苗不可比擬的。由于DNA疫苗具有這一與弱毒疫苗相同的優(yōu)點，當(dāng)強(qiáng)毒株弱化困難或弱毒株具有潛在毒力返強(qiáng)危險時，DNA疫苗可能成為弱毒疫苗極有希望的取代者。其次，對于易發(fā)生變異或血清型較多的病原時，進(jìn)行多價活毒疫苗研制極為困難。相反，DNA疫苗則極具潛力，由于克隆病原的免疫原基因相對更為容易，獲取多種基因的表達(dá)質(zhì)粒，研究多價DNA疫苗在理論和實踐上都是簡易而可行的。DNA疫苗應(yīng)用的關(guān)鍵性問題是如何提高誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答效率。為了增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果，常采用引入細(xì)胞因子作佐劑，將抗原基因與細(xì)胞因子質(zhì)粒聯(lián)合注射或共表達(dá)的方法。細(xì)胞因子的免疫佐劑作用已在乙肝疫苗、腫瘤免疫和其它疫苗的研制中得到了廣泛的應(yīng)用。常用的細(xì)胞因子包括IL-2、IL-12、IL-6、IL-18、IL-13、GM-CSF和IFN-γ等。 這些細(xì)胞因子既可調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性抗體反應(yīng)，又可增強(qiáng)機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫。構(gòu)建細(xì)胞因子與抗原共同表達(dá)的核酸疫苗，通過細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)作用，能優(yōu)化宿主的特異性免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力，尤其是對免疫力低下和免疫缺陷的個體具有十分重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是預(yù)防PCV2的單一抗原的DNA疫苗攻毒保護(hù)力較低，將豬白細(xì)胞介素-18(pIL-18)作為疫苗的一種重要的細(xì)胞免疫佐劑，制備一種豬圓環(huán)病毒II 型核酸疫苗。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是一種豬圓環(huán)病毒II型核酸疫苗，在真核表達(dá)載體PlRES的 2個多克隆位點中分別插入了豬圓環(huán)病毒II型LY株0RF2和豬IL-18基因，所述核酸疫苗共表達(dá)豬圓環(huán)病毒II型LY株Cap和豬IL-18蛋白。所述的豬圓環(huán)病毒II型核酸疫苗的制備方法，它的步驟如下(1)設(shè)計并合成了針對豬IL-18的引物pIL18fs/pIL18rs上游引物pIL18fs 為 5，-TAAGTCGACATGGCTGCTGAACCGGA-3’，下游引物pIL18rs 為 5，-CGTGCGGCCGCTTAGTTCTTGTTTTG-3’,上、下游引物分別加入Sal I和Not I酶切位點，擴(kuò)增長度為599bp ；設(shè)計并合成了針對豬0RF2的引物0RF2fs/0RF2rs上游弓丨物0RF2fs 為 5，-CTTACTCGAGATGACGTATCCAAGGAG-3，，下游弓丨物0RF2rs 為 5，-CGGGACGCGTATTCATTAAGGGTTA本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
１．一種豬圓環(huán)病毒ＩＩ型核酸疫苗，其特征在于：在真核表達(dá)載體ｐＩＲＥＳ的２個多克隆位點中分別插入了豬圓環(huán)病毒ＩＩ型ＬＹ株ＯＲＦ２和豬ＩＬ－１８基因，所述核酸疫苗共表達(dá)豬圓環(huán)病毒ＩＩ型ＬＹ株Ｃａｐ和豬ＩＬ－１８蛋白。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳紅英，崔保安，李新生，魏戰(zhàn)勇，劉金朋，王淑娟，朱前磊，王亞丹，王子馨，李坤，
申請(專利權(quán))人：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：41
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。