一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉換酶抑制肽的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉換酶抑制肽的方法，包括將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮處理除脂，選用胃蛋白酶在在水解溫度35～38℃，pH為1.5～2.5，酶與底物的比為2～3％，底物濃度為1～3％條件下水解魷魚肝臟蛋白18～25h；將酶解液進行超濾處理后，跟蹤其ACE抑制活性，應用凝膠過濾層析、DEAE陰離胃子交換、RP-HPLC等方法分離純化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在溫度2～100℃、pH值1～12之間對ACE的抑制活性基本沒有變化，比較穩定，而且模擬胃腸消化實驗對組分的ACE抑制活性的影響不大，經過胃腸消化后仍具有較高的ACE抑制活性。本方法不僅工藝合理，易操作，而且減少了廢物排放，變廢為寶，制得的ACE抑制肽可應用于開發具有降血壓功能食品及醫藥領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及魷魚肝臟蛋白深加工的方法，尤其涉及一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽的方法。
技術介紹
魷魚加工過程中有約占魷魚體重30%的頭、足、肝臟及表皮等廢棄物產生。對于這些廢棄物，一般的處理方法是加工魚粉，或者掩埋，這不但是對漁業資源的巨大浪費，而且還存在著環境污染的問題。在國外，如西班牙和日本對于魷魚肝臟的利用采用自身酶解發酵法生產魷溶漿、魷魚粉等作為魚類飼料。在國內魷魚肝臟的利用和研究還有比較大的發展空間，目前僅有魷魚肝臟干粉的加工，并且是用作飼料，技術水平不高。目前，有從魷魚皮制備膠原蛋白活性肽，如專利號為200710013140. 2，一種魷魚皮膠原蛋白活性肽的制備，將魷魚皮用清水洗凈，加入NaOH的水溶液浸泡，再用清水反復洗滌至pH中性；加入稀酸水溶液浸泡，再洗滌至PH中性；攪拌下，在熱水中抽提膠原蛋白，過濾除去不溶物；在攪拌下，加酶酶解l_6h，酶解溫度為40-50°C，在90-100°C下滅酶4-lOmin ；用堿液調pH至中性，酶解液經過濾后，再依次經過截留分子量為8KD的超濾膜超濾、納濾脫鹽，最后真空濃縮，噴霧干燥。產品具有很強的生物活性，可用于制備抗氧化、降血壓、抗動脈粥樣硬化或美容的保健食品或藥品。但是它是從魷魚皮來制取。本研究的目的就是從廢棄的魷魚肝臟中提取蛋白質和生物活性肽，以使寶貴的蛋白質和油脂資源得以綜合利用，提高附加值，減少廢棄物的排放，凈化環境。魷魚肝臟中提取生物活性肽的研究，可提供消化吸收效率更高的蛋白質水解產物，用于食品和飼料行業，而且制備的生物活性肽還可應用于疾病的防治，能為維護人類的健康作貢獻。目前，有許多不同種類的藥物應用于高血壓的治療，其中血管緊張素轉換酶(ACE) 抑制肽(即降血壓活性肽)是一種治療高血壓的主要藥物。從1981年第一個口服有效的人工合成ACE抑制劑卡托普利(Captopril)批準使用以來，現在應用于臨床上的ACE抑制劑已達18種，但人工合成的ACE抑制劑在臨床應用過程中往往會產生副作用，如咳嗽、味覺功能紊亂及皮疹等。因此，尋找天然的ACE抑制劑引起了研究者的極大興趣。試驗表明，天然的ACE抑制肽對自發性高血壓大鼠(SHR)及高血壓患者具有降壓作用，而對正常血壓大鼠及人無降壓作用。另外，這些肽是經食品級酶在混合條件下處理獲得的，其安全性高。ACE 抑制肽在開發具有降血壓功能的功能食品中具有廣闊前景。目前生產ACE抑制肽的方法大體有三種一是提取存在于生物體中的各類天然 ACE抑制肽；二是通過化學法或酶法水解蛋白質，化學法常采用加熱和酸處理的方法，而體外蛋白酶水解包括直接酶解和利用微生物間接酶解兩類；三是用重組DNA技術、酶法、化學法合成活性肽。其中，酶解蛋白質生產ACE抑制肽因其安全性高、能在溫和的條件下進行定位水解分裂產生特定的肽段，而且水解過程易受控制，價廉易推廣，引起人們的極大興趣。因而近幾年報道的ACE抑制肽的制備方法皆為酶解法，酶的選擇是酶解法生產活性肽的關鍵，應根據酶的專一性從眾多的蛋白酶中篩選出能水解所需肽段，目前廣泛使用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。由于ACE抑制肽的氨基酸組成和結構差別均較大，沒有一個固定或較特殊的氨基酸組成，并且蛋白酶解產物成分相當復雜，這就增加了它的分離提取難度。因此，建立一套適宜的分離提取技術工藝是將ACE抑制肽推向商業化生產的必要條件。ACE抑制肽的分離提取甚至結構鑒定是一項最復雜，也是最有意義的工作。所用的分離純化的方法主要有離子交換樹脂、超濾、凝膠過濾色譜、高效液相色譜、聚丙稀酰胺凝較電泳等。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是根據上述技術現狀提供一種從廢棄的魷魚肝臟中提取蛋白質進而制備血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽的方法，提取分離工藝合理，易控制易操作，制得的活性肽具有較高的活性。本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為，其特征在于包括以下步驟1)采取丙酮浸提法提取魷魚肝臟蛋白將魷魚肝臟與水按質量比1 1 1 1.5 混合，充入氮氣10 20分鐘，加入占魷魚肝臟重量0. 1 0. 5 %的L-抗壞血酸-6-棕櫚酸酯抗氧劑，放入高壓鍋中處理20 30min，離心處理，除去上層魚油，用丙酮洗滌數次，將組織脫水制成丙酮粉，真空干燥即得脫脂魷魚肝臟蛋白；2)用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白以脫脂魷魚肝臟蛋白為底物，在水解溫度35 38°C，pH為1. 5-2. 5，酶與底物的比為2 3%，底物濃度為1 3%條件下水解魷魚肝臟蛋白18 25h，其中百分比為質量百分比；3)將得到的魷魚肝臟蛋白酶解液進行超濾處理；4)將超濾后的產物用kphadex G_50凝膠柱初步分離，得到粗分物的ACE抑制肽；5)在粗分物的ACE抑制肽中選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱進行分離純化；6)將純化后得到的活性高的組分用kphadex LH-20繼續分離純化；7)最后檢測純度，得到血管緊張素轉換酶抑制肽。所述步驟3的超濾處理的過程為1)采用超濾裝置將魷魚肝臟蛋白酶解液進行超濾，濾膜為截留分子量IkDa 30kDao2)將截留液用蒸餾水稀釋后繼續超濾，合并收集的超濾液并進行冷凍干燥。所述步驟1中離心處理工藝為4000 10000rpm/min處理20 40min。所述步驟4的凝膠柱初步分離的工藝為將超濾后凍干樣品溶解，用蒸餾水進行洗脫，流速為20 40mL/h，優選30mL/h，紫外檢測儀HD2-CA,檢測波長280nm ；并測定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制濃度(IC5tl)達到2. 10 5. 08mg/mL。將得到的對ACE抑制活性高的粗分物組分進行穩定性及抑制模式分析。所述的凝膠柱中凝膠采用葡萄糖凝膠，分離的分子量為lOOODa-lOOOODa。所述步驟5的分離純化具體過程為選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱分離，上樣先用水洗脫，再用0 lmol/LNaCl溶液進行線性洗脫，流速為20 ^mL/h，優選 24mL/h，并測定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制濃度(IC5tl)達到1. 80 2. 10mg/mL。所述步驟6的分離純化工藝條件為洗脫液為25 35% (wt)的甲醇溶液，優選 30 %的甲醇溶液，流速為20 ^mL/h，優選24mL/h，并測定各肽峰抑制ACE的活性。其半抑制濃度(IC50)達到1. 50 1. 80mg/mL。所述步驟7的檢測純度是采用反相高效液相色譜C18柱檢測純度，洗脫液甲為含 0. 01 % 0. 03 % TFA的水，洗脫液乙為含0. 01 % 0. 03 % TFA的乙腈溶液，先用5 % 10 % 的甲液洗脫，再用洗脫梯度為95% 98%乙液洗脫，流速為20 24mL/h。所述步驟2中胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白的工藝參數優選為底物濃度2.5%，酶與底物比2%，在36°C條件下酶解20h。所述高壓鍋采用115 125 °C。與現有技術相比，本專利技術的優點在于本專利技術是對魷魚肝臟廢棄物的綜合利用研究，將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮處理除脂，用胃蛋白酶進行酶解，并對其酶解條件進行優化，并將酶解液進行超濾處理、凝膠過濾層析、DEAE陰離胃子交換、RP-HPLC等方法分離純化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在溫度2 100°本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉換酶抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟：１）采取丙酮浸提法提取魷魚肝臟蛋白：將魷魚肝臟與水按質量比１∶１～１∶１．５混合，充入氮氣１０～２０分鐘，加入占魷魚肝臟重量０．１～０．５％的Ｌ－抗壞血酸－６－棕櫚酸酯抗氧劑，放入高壓鍋中處理２０～３０ｍｉｎ，離心處理，除去上層魚油，用丙酮洗滌數次，將組織脫水制成丙酮粉，真空干燥即得脫脂魷魚肝臟蛋白；２）用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白：以脫脂魷魚肝臟蛋白為底物，在水解溫度３５～３８℃，ｐＨ為１．５－２．５，酶與底物的比為２～３％，底物濃度為１～３％條件下水解魷魚肝臟蛋白１８～２５ｈ，其中百分比為質量百分比；３）將得到的魷魚肝臟蛋白酶解液進行超濾處理；４）將超濾后的產物用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０凝膠柱初步分離，得到粗分物的ＡＣＥ抑制肽；５）在粗分物的ＡＣＥ抑制肽中選取活性高的組分用ＤＥＡＥ陰離子交換柱進行分離純化；６）將純化后得到的活性高的組分用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０繼續分離純化；７）最后檢測純度，得到血管緊張素轉換酶抑制肽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝超，霍建聰，丁璞，
申請(專利權)人：浙江海洋學院，
類型：發明
國別省市：33