高靈敏檢測重金屬汞的生物傳感器細胞及其制造方法技術

本發明專利技術涉及檢測水溶性樣品中汞污染的生物傳感器細胞及其制造方法。利用金屬調節蛋白MerR，紅色熒光蛋白mCherry和甲基汞裂解酶MerB，用大腸桿菌作為宿主菌，構建了各種能檢測無機汞離子和甲基汞(0.1-5000nM)的生物傳感器細胞。通過引入汞離子運輸蛋白MerT或具有放大功能的基因級聯表達系統(基因電路)，包括細菌噬菌體的PRM-cI系統和惡臭假單胞菌的Pm-XylS2系統，可以提高生物傳感器細胞在檢測低濃度重金屬汞的檢測靈敏度1-2倍。通過定向進化和高通量篩選獲得23個MerR突變體，用突變體MerR構建的生物傳感器細胞可以大幅度提高檢測靈敏度。這些生物傳感器細胞檢測汞離子和甲基汞污染時，具有高度的專一性，不受其他金屬離子的存在的影響，具有廣泛的適應性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于環境生物
，特別涉及高靈敏檢測環境中溶液樣品中重金屬汞的生物傳感器細胞及其制造方法。
技術介紹
汞(Hg)是主要的有害金屬污染物，可以在常見的工業和/或農業廢物中發現 Ghang和Wong，2007)。自然界中很難發現純的液態金屬汞，更多的是以化合物和無機鹽的形態出現。汞可以單價汞或二價汞的形式和其它化合物結合(也可分別表示為Hg(I)和 Hg(II)或Hg2+)。被排放出的汞的化學形態(或類型形成)隨著來源類型和其他因素而不同。由于不同類型的汞有不同的毒性，因此對人類健康和其他生物有機體環境的影響也不同。汞可以在不同的形態間轉換，在循環時形成各種形態，對人類和環境造成毒害。當汞與碳結合時就形成有機汞化合物或有機金屬汞。在環境中最常見的有機汞化合物是甲基汞。通常認為它在環境中的形成主要是由于微生物等作用的生物過程。由于汞各種形態的轉換，人為排放就導致環境中甲基汞的形成。目前在許多可食的淡水魚、海水魚及海洋哺乳動物中，甲基汞能夠增至周圍水體中含量的幾千倍(生物累積及生物放大作用)，它已經受到得到了人們嚴重的關注。準確檢測和監控環境中，特別是水域中汞存在和污染直接影響到人們的日常生產和生活。多年的研究開發產生了各種檢測汞的常規技術手段及裝置，并且具有很好的靈敏性，如原子吸收光譜法(0. 02ppb)，原子力光譜法(0. OOlppt)，原子發射光譜法(0. Olppt) 和電感耦合等離子體質譜法(0. 08ppt)，但是這些檢測手段和裝置的使用具有極大的局限性和花費昂，同時需要培訓專業人員來操作相關儀器設備(Knecht *kthi，2009)。更為重要的是這些常規的檢測方法不能測定污染金屬的生物可利用濃度(Bioavailable concentration)，就是環境中污染金屬總數中活的生物體可以利用的數量。這就需要在結合傳統物理和化學檢測方法的同時，要利用生物檢測方法。基于這個原因，近年來開發生物傳感器檢測汞及其他金屬的污染越來越受到人們的極度重視。生物傳感器是一種分析檢測裝置，通常由一個固定化的生物材料緊密地與一個與之兼容的傳感器所組成，能把生物信號轉換為易于量化的電信號。生物材料負責專一性地識別待分析物并產生生物信號，而理化傳感器則感應和擴增生化信號并輸出相應的可測電信號(kheller等，1991)。生物傳感器不僅可以有效地測量包括汞在內的多種金屬污染物，而且基于生物學基礎它們也是可測量的各種有毒物質的理想選擇。此外，易于復制和相對低的成本是生物傳感器具有較大的競爭力。全細胞生物傳感器是以完整活細胞作為生物材料來專一性識別待分析物并產生相應的生物信號(Heim等，1999)。全細胞的生物傳感器具有比傳統的分析方法和其他生物傳感器，如蛋白質、酶活多糖傳感器有許多優點1)細胞，尤其是微生物細胞總是比純化的蛋白質或酶等更便宜，并且生物分子在細胞環境中有更好的活性。2、細胞中特定代謝途徑的使用可以使待測化合物或污染物，尤其是芳香族化合物和重金屬，有更好地被選擇性識別。3)全細胞傳感器具有更好的穩定性，可以使用相對長的時間。4)全細胞系統更易實現高通量的自動化操作。幻只有全細胞生物傳感器可以實現生態毒性試驗和污染物的環境監測。全細胞生物傳感器可分為兩大類，一類是基于組成型表達，另一類是基于誘導表達的。組成型表達系統通常利用在細胞正常生長條件下具有高活性的啟動子，從而是報告基因能有較高的基礎表達水平。而在有害或有毒的條件下，這個基礎表達水平就下降，表達水平的下降是與待測樣品的毒性相關。因此組成型表達系統的生物傳感器提供了單個細胞或培養物代謝狀態的“大畫面”，任何降低細胞生長或導致細胞毒害的與對照組相比都會降低報告基因的信號量。而誘導表達系統中報告基因與誘導型啟動子相融合，誘導型啟動子可響應特定的脅迫(如熱激，氧化性損傷，DNA損傷等)或化合物(有機污染物和重金屬)。 通過測定報告基因的表達水平來反應誘導物的數量水平。誘導系統的關鍵優點是專一性響應誘導物(代測分析物)，允許定量檢測單一的待測物。隨著越來越多的響應特定脅迫或化合物的基因被定位和克隆，人們就可能克隆出這些基因的啟動子并把它們與許多報告基因相融合。另外，因為這些啟動子的獨特專一性， 無數啟動子和報告基因的組合被用于檢測廣泛的誘導物(待測分析物)。專一性的啟動子和報告基因的融合可以克隆在質粒上，也可插入到某些細菌的基因組中。這個新的重組生物傳感器是通常被稱為基因工程菌(GEM)的生物傳感器細胞。最近研究細菌系統有毒金屬離子抗性的進展導致依賴金屬的轉錄因子MerR家族的發現，MerR家族轉錄因子在多種細胞類型都有存在。MerR家族轉錄激活子的原型是革蘭氏陰性細菌汞抗性(mer)操縱子中的調節因子，通常在轉座子Tn21和Tn501中存在(Brown et. al. 1983)。在二價汞鹽存在時，這個調節子是mer基因的激活因子，而沒有二價汞離子存在時，是個微弱的阻遏因子(Lund和Brown，1987)。)隨后的多種細菌中其他金屬抗性、 一些藥物抗性和一些脅迫響應基因的研究表明這些轉錄調節因子也都屬于MerR家族。所有MerR家族蛋白是轉錄激活因子。它們通過N端啟動子DNA結合域和C端誘導物結合域的清楚分離來區別。在DNA結合域它們有較高的氨基酸序列相似性，但是誘導物結合域則有低的相似性。在沒有二價汞時，MerR蛋白以阻遏子構象與DNA結合，使啟動子維持阻遏狀態。當二價汞離子與MerR蛋白兩個結合位點的其中之一結合就引起構象變化，使MerR處于激活構象。MerR家族的其他成員被認為也是通過類似的機制來發揮作用， 但是根據C端誘導物結合域的不同，需要有不同的金屬離子，如Cu (II)，Cd(II)，Pb (II)和 Zn(II)等作為轉錄誘導物。當受MerR或MerR類蛋白調節的啟動子與易于檢測的報告基因，如各種熒光蛋白 (如emGFP，eYFP，eBFP或mCherry)相融合時，調節蛋白與金屬離子結合后對報告基因的轉錄激活仍然是可誘導的。由這些重組報告基因出發各種檢測金屬的遺傳改造生物傳感器就可以制備出來。這些遺傳改造生物傳感器在檢測金屬污染物時是高度專一性的，同時重組細菌與專一性金屬離子接觸后可以產生可以定量的熒光信號。準備高質量的遺傳改造生物傳感器用于檢測重金屬的關鍵因素是依賴金屬結合蛋白的專一性和親和性。然而，天然金屬結合蛋白的一些局限性極大地限制了遺傳改造生物傳感器應用潛力1)天然MerR或MerR類似蛋白經常只有非常窄的對金屬離子響應范圍；2)，它們通常受到其他金屬離子的非特異性結合干擾；3)它們只能夠在狹窄的溫度范圍激活轉錄發揮作用，不太適宜高溫調節下地表下的原位應用。為了克服上述缺點，使全細胞生物傳感器可以有效地檢測和監測各種環境條件的重金屬污染，我們首先采用了合成生物學和蛋白質定向進化技術來開發出新穎的，具有對汞離子有較高的特異性和結合親和性的生物傳感器細胞。該重 組細胞將用于建造低成本的微尺度，可以進行現場監測和檢測汞污染物的全細胞生物傳感器。該技術可以進一步應用到設計其他生物傳感器細胞來專一性檢測其他重金屬污染物或放射性核素。
技術實現思路
幾十年來汞一直是眾所周知的嚴重環境污染物，泄露到環境中的汞可能本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．檢測水溶性樣品中汞污染的生物傳感器細胞及其生物制造方法，所述制造方法包括如下：

【技術特征摘要】
1.檢測水溶性樣品中汞污染的生物傳感器細胞及其生物制造方法，所述制造方法包括如下2.按權利要求1，通過用金屬調節蛋白MerR基因(包括啟動子區域)和紅色熒光蛋白 mCherry基因組成汞離子誘導的基因表達系統并導入宿主菌大腸桿菌中得到生物傳感器細胞。該傳感器細胞可以專一性地在15-40°C，pH4-9條件下在0. 5-8小時內檢測1_5000ηΜ 無機二價汞離子污染溶液。3.按權利要求2，在MerR基因和mCherry基因組成汞離子誘導的基因表達系統中引入甲基汞裂解酶基因MerB后所得生物傳感器細胞可以專一性地在15_40°C，pH4_9條件下在 0. 5-8小時內檢測1-300ηΜ甲基汞污染溶液。4.按權利要求2，在MerR基因和mCherry基因組成汞離子誘導的基因表達系統中引入汞離子運輸蛋白基因MerT后所得生物傳感器細胞。該傳感器細胞可以專一性地在 15-40°C,pH4-9條件下在0. 5-8小時內檢測1_5000ηΜ無機二價汞離子污染溶液。5.按權利要求2，在MerR基因和mCherry基因組成汞離子誘導的基因表達系統中引入由來源于細菌λ噬菌體PRM-cI和MerR組成的基因級聯放大系統后所得生物傳感器細胞。 ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王欽宏，方向東，
申請(專利權)人：天津工業生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：12