基于量子點技術的一種非洲豬瘟檢測方法技術

一種納米材料領域的基于量子點基礎上的免疫組化分析檢測方法，包括如下步驟：(1)首先將量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液中，然后加入硫化二亞胺和二抗，混合，反應，離心，洗滌，得到量子點標記的非洲豬瘟單克隆抗體復合物；其中，量子點∶硫化二亞胺∶二抗摩爾比為60∶15∶1；或者(2)首先將量子點分散在含有體積分數為1.25％的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，分散，反應，加入二抗，反應，離心，洗滌，得到量子點標記的非洲豬瘟單克隆抗體復合物；其中，量子點∶戊二醛∶二抗摩爾比為60∶15∶1；之后按照標準免疫組化檢測方法進行免疫反應和觀察。本發明專利技術的方法用熒光顯微鏡直接進行觀察，簡單易行，熒光光穩定性增加，分析的準確度和檢測的靈敏度有所提高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種納米
的檢測方法，具體說是一種。
技術介紹
免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究。由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還需要借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸、及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。作為一種操作簡單、檢測快速、結果可靠的組織樣本中蛋白檢測方法，免疫組化正越來越多的地應用于醫學研究及臨床診斷中。用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現代生物學和醫學中廣泛應用的方法之一，包括熒光抗體和熒光抗原技術，具有抗原抗體反應的特異性，染色技術的快速性，在細胞或組織上定位的準確性，以及熒光效應的靈敏性等優勢。但是，目前常用的熒光素多是有機染料，存在熒光強度隨時間的延長而逐漸消退，結果不易長期保存等缺點，在普及應用上受到一定的限制。量子點(QDs)特指半徑小于或接近激子波爾半徑的半導體納米顆粒，由于其具有發射光譜窄且具有尺寸“調諧”特性，用單個波長即可激發不同的量子點，熒光量子產率高， 穩定性好，很好的生物相容性等優點，在生物醫藥標識方面，量子點巨大的研究和應用價值逐步被看好。通過將量子點連接在抗原或者抗體上，形成量子點標記的抗原(抗體)復合物，借助于組織化學方法直接進行顯色反應，可以顯示細胞或組織中的化學成分，在熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內或者組織中發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布及其含量。另外，量子點寬的吸收峰和窄的吸收峰使得在一個簡單的系統中進行多色多通道分析檢測成為可能。量子點基礎上的免疫組化分析方法，具有以下有點光穩定性增加，高靈敏度，與現有化學發光比較靈敏度高或者相當；線性強，提高蛋白表達量；與現有的成像系統相容， 不用專用設備；節約實踐和成本；多色檢測，可以在同一個檢測窗口觀測到多個抗體的存在并決定他們的濃度，比單色檢測降低成本。用量子點標記的免疫組化檢測方法，可以大大加速并且提高檢測的靈敏度和分析的準確度。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于。本專利技術的方法用熒光顯微鏡直接進行觀察判斷，省去了染色、復染、脫水、 透明等操作，更簡單易行，節約時間和成本；而且熒光光穩定性增加，與現有免疫組織化學顯色方法相比較，分析的準確度和檢測的靈敏度有所提高。本專利技術是通過以下技術方案實現的，本專利技術包括如下步驟步驟一，將表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點與非洲豬瘟單克隆抗體連接(1)如果是表面帶有羧基的水溶性量子點，則首先將量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液中，然后加入硫化二亞胺和單克隆抗體，混合，25°C下反應3小時，離心，洗滌，得到量子點標記的單克隆抗體復合物；其中，量子點硫化二亞胺單抗的摩爾比為60 15 1 ；(2)如果是表面帶有氨基的水溶性量子點，則首先將量子點分散在含有體積分數為1.25%的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，超聲使之完全分散，25°C下搖床活化反應3小時，加入單抗，在4°C下反應M小時，離心，洗滌，得到量子點標記的單抗復合物；其中，量子點 戊二醛單抗的摩爾比為60 15 1 ；步驟二，將切片標本先放入二甲苯中脫蠟2次，然后置入無水乙醇中梯度水化， 水洗，過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶，微波抗原修復，水洗后用BSA封閉，4°C反應過夜， 磷酸緩沖溶液洗后加入量子點標記的非洲豬瘟單克隆抗體復合物，避光條件下37°C反應 30-60分鐘，磷酸緩沖溶液漂洗，甘油封片；磷酸緩沖溶液替代抗體復合物作為陰性對照， 在熒光顯微鏡下觀察樣本。步驟一中，所述硼酸鹽緩沖溶液的PH為8. 32。步驟一中，所述磷酸緩沖溶液的PH為7. 2。步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點為hP，InAs, InCaAs, InAs/ Cdse, InAs/ZnSe, InAs/InP, ZnS, CdS, HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, PbSe, HgTe, CaAs, CdS/ZnS, CdS/Pbs, ZnS/CdS, ZnS/CdS, CdSe/CdS, CdSe/Cuse, CdSe/HgTe, CdSe/ZnSe, CdSe/HgSe, CdTe, MgS, Mgse，MgTe, CaS, Case 或 CaTe 中的一種或幾種的組合。步驟一中，所述表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點，發射波長為520nm-680nm。步驟二中，所述量子點標記的非洲豬瘟單克隆抗體復合物具體為，將步驟一得到的量子點標記的抗體復合物稀釋200倍。本專利技術利用量子點的熒光特性，將其與抗體(抗原)偶聯，直接與細胞或者組織中的相關抗原(抗體)反應并顯色，以確定細胞或者組織中的化學成分及其分布。本專利技術根據量子點半徑的不同，以細胞出現各種綠色、黃色、橙紅色的熒光信號的為陽性。本專利技術具有如下的有益效果本專利技術是基于標準的免疫組織化學方法基礎上的， 利用納米量子點的熒光性能，不用傳統的顯色過程，而是用熒光顯微鏡直接進行觀察判斷， 省去了染色、復染、脫水、透明等操作，更簡單易行，節約時間和成本；而且熒光光穩定性增加，與現有免疫組織化學顯色方法相比較，分析的準確度和檢測的靈敏度有所提高。具體實施例方式下面對本專利技術的實施例做詳細說明本實施例在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例。實施例檢測方法分析非洲豬瘟病毒在豬脾臟及扁桃體中是否存在，使用量子點標記的非洲豬瘟病毒單克隆抗體，磷酸緩沖溶液(PBS)替代該單抗做陰性對照。硼酸鹽緩沖溶液的配方為十水四硼酸鈉3. 81g，加雙蒸水定容到1000ml，PH為8. 32。磷酸緩沖溶液的配方為氯化鈉8g氯化鉀0. 2g磷酸氫二鈉 1. 44g磷酸二氫鉀 0. 24g加雙蒸水至IOOOml，PH調至7. 2。步驟一，將表面帶有羧基的水溶性CdTe量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液(PH = 8.32)中，加入硫化二亞胺(EDC)和非洲豬瘟病毒單克隆抗體，漩渦混合振蕩均勻，25°C反應3小時，反應溶液高速離心，用磷酸緩沖溶液(PBS，0. 1M，PH= 7. 2)多次洗滌，得到量子點標記的單抗復合物(QDl-antibody)；或者將表面帶有氨基的CcKeOZnS水溶性量子點分散在含有體積分數為1. 25%的戊二醛濃度的磷酸緩沖溶液(PH = 7. 2)中，超聲使之完全分散，搖床活化25°C反應3小時， 加入非洲豬瘟病毒單克隆抗體，在4°C下反應M小時，反應溶液離心，用磷酸緩沖溶液(PH =7. 2)多次洗滌，得到量子點標記的單抗復合物(QD2-antib0dy)。步驟二，選取多種豬的脾臟和扁桃體作為樣本，以豬的肌肉組織為對照，應用基于量子點的免疫組織化學的方法來定性分析檢測非洲豬瘟本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．基于量子點技術的一種非洲豬瘟檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一，將表面帶有羧基或氨基的水溶性量子點與非洲豬瘟單克隆抗體連接，（１）如果是表面帶有羧基的水溶性量子點，則首先將量子點分散在硼酸鹽緩沖溶液中，然后加入硫化二亞胺和二抗，混合，２５℃下反應３小時，離心，洗滌，得到量子點標記的抗體復合物；其中，量子點∶硫化二亞胺∶二抗的摩爾比為６０∶１５∶１；（２）如果是表面帶有氨基的水溶性量子點，則首先將量子點分散在含有體積分數為１．２５％的戊二醛的磷酸緩沖溶液中，超聲使之完全分散，２５℃下搖床活化反應３小時，加入抗體，在４℃下反應２４小時，離心，洗滌，得到量子點標記的抗體復合物；其中，量子點∶戊二醛∶二抗的摩爾比為６０∶１５∶１；步驟二，將切片標本先放入二甲苯中脫蠟２次，然后置入無水乙醇中梯度水化，水洗，過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶，微波抗原修復，水洗后用ＢＳＡ封閉，４℃反應過夜，磷酸緩沖溶液先后加入量子點標記的抗體復合物，避光條件下３７℃反應３０－６０分鐘，磷酸緩沖溶液漂洗，甘油封片；磷酸緩沖溶液替代一抗作為陰性對照，在熒光顯微鏡下觀察樣本。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳文剛，
申請(專利權)人：陳文剛，
類型：發明
國別省市：12