乳清蛋白的規模純化方法技術

一種生物工程技術領域的乳清蛋白的規模純化方法，通過以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經預處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛β-乳球蛋白。本發明專利技術能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白，降低生產成本，提高了生產效率。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是一種生物工程
的方法，具體是一種。
技術介紹
α -乳清白蛋白廣泛存在于哺乳動物乳中，是β -1,4-半乳糖苷轉移酶的調節亞基，催化乳糖的合成。α-乳清白蛋白的氨基酸組成中包含大量的人體營養所必需的氨基酸，具有重要的營養價值。人α-乳清白蛋白多聚體或折疊變異體能夠誘導腫瘤細胞凋亡，有望開發成治療癌癥的臨床藥物。α-乳清白蛋白是乳清蛋白的一種。中國專利 200610076242建立了轉人α -乳清蛋白基因的重組克隆大型家畜的生產方法，為規模生產重組人α-乳清蛋白用作臨床藥物和功能食品奠定了基礎。轉基因動物乳液中除重組人乳清蛋白外，還有動物自身表達的乳清蛋白，這類同種異源蛋白結構很相似，理化性質接近， 規模分離制備非常困難。經過對專利文獻檢索發現，中國專利申請號200810118961. 7 “異源同種乳清蛋白的分離純化方法”，采用疏水層析和凝膠過濾層析兩步法純化α -乳清白蛋白，先采用疏水層析得到目標蛋白粗品，再用凝膠過濾層析精制；該純化方法步驟較多，操作復雜，效率低下。中國專利申請號200910161153. 3 “乳清蛋白的分離和測定方法”采用以亞乙基橋雜化 (BEH)顆粒為填料的超高效液相色譜柱的方法將α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白分離；美國專利號75Μ932酸性條件預處理后，采用陰離子交換法和梯度洗脫純化α-乳清白蛋白； 美國專利號5503864是結合了等電點沉淀和膜過濾的方法，雖然操作簡便，但是選擇性低， 產品純度低。這些方法要么操作步驟多，要么難于進行規模放大實現規模生產。因此，需要建立一種簡便高效、成本低、生產規模易于放大的重組人乳清蛋白純化方法。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術存在的上述不足，提供一種，能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白，降低生產成本，提高了生產效率。本專利技術是通過以下技術方案實現的，本專利技術通過以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經預處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛乳球蛋白。所述的人α-乳清白蛋白重組牛乳采用市售或取自中國農業大學李寧教授實驗室提供。所述的預處理是指在有保護劑的條件下將乳樣品加熱至60°C _95°C并保溫 lOmin-eOmin后，冷卻至室溫并除去沉淀，收集清液富含β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白的清液。所述的保護劑采用濃度為0. 05-0. 4Μ的CaCl2的水溶液。所述的陰離子交換層析分離是指用市售的陰離子交換介質制成離子交換層析柱，將熱處理后的產物流經離子交換層析柱，具體步驟包括在50-150mM，pH 6. 4-8. 4的 Tris-HCl的平衡條件下使得β -乳球蛋白和α -乳清白蛋白不同程度的吸附在離子交換層析柱上，最后用電導6. 9-13. 5ms/cm的NaCl-50mM，pH 7. 4的1Tris-HCl的洗脫液一步洗脫并收集不同的洗脫峰，三種蛋白被分別洗脫下來，依次得到牛α-乳清白、人α-乳清白和牛乳球蛋白，達到分離純化人α-乳清白蛋白的目的。本專利技術將乳清蛋白生產中步驟減少到了兩步，其中預處理可以實現α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白總含量達到99%以上，離子交換處理步驟一步洗脫取得重組人α-乳清白蛋白純度90%以上；因而能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白， 降低生產成本，提高了生產效率。具體實施例方式下面對本專利技術的實施例作詳細說明，本實施例在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1取重組牛奶粉，按1 8(w/v)加入去離子水，離心脫脂，取乳清分裝成多份，分別調 CaCl2 終濃度 0. 0,0. 05，0. 1,0. 15，0. 2,0. 25，0. 3,0. 4M，然后分別加熱至溫度:70°C， 75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，保溫 IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min ；反應完畢后， 將各管于4°C，9800rpm,離心lOmin，上清轉移至新管并加入NaCO3,離心除去CaCl2，用200mL PH 7. 0，IOmM磷酸鈉緩沖液將沉淀洗滌三次后溶起。13. 5% SDS-PAGE分析上清和沉淀蛋白組成，并對上清進行蛋白定量的測定。濃縮樣品總α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白總含量最高可達到99%以上。表1顯示了乳清樣品在不同濃度CaCl2加熱95°C保溫5min的蛋白濃度結果；表2顯示了乳清樣品在0. 2M CaCl2條件下加熱不同溫度保溫20min的結果；表3顯示75°C 了保溫不同時間的效果。再用5KD再生纖維素復合膜初步濃縮，去除部分鹽離子，加去離子水除鹽，得乳清預處理樣品表權利要求1.一種，其特征在于，通過以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經預處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛乳球蛋白。2.根據權利要求1所述的，其特征是，所述的預處理是指在有保護劑的條件下將乳樣品加熱至60°C _95°C并保溫lOmin-eOmin后，冷卻至室溫并除去沉淀，收集清液富含乳球蛋白和α-乳清白蛋白的清液。3.根據權利要求1所述的，其特征是，所述的保護劑采用濃度為0. 05-0. 4Μ的CaCl2的水溶液。4.根據權利要求1所述的，其特征是，所述的陰離子交換層析分離是指用市售的陰離子交換介質制成離子交換層析柱，將熱處理后的產物流經離子交換層析柱。5.根據權利要求1或4所述的根據權利要求1所述的，其特征是，所述的陰離子交換層析分離的具體步驟包括在50-150mM，pH 6. 4-8. 4的Tris-HCl 的平衡條件下使得乳球蛋白和α-乳清白蛋白不同程度的吸附在離子交換層析柱上， 最后用電導6. 9-13. 5ms/cm的NaCl-50mM，pH 7. 4的1Tris-HCl的洗脫液一步洗脫并收集不同的洗脫峰，三種蛋白被分別洗脫下來，依次得到牛α-乳清白、人α-乳清白和牛β-乳球蛋白，達到分離純化人α-乳清白蛋白的目的。全文摘要一種生物工程
的，通過以人α-乳清白蛋白重組牛乳為原料，經預處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α-乳清白蛋白、牛α-乳清白蛋白和牛β-乳球蛋白。本專利技術能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化重組人α-乳清白蛋白，降低生產成本，提高了生產效率。文檔編號C07K14/76GK102286096SQ20111019173公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月8日 優先權日2011年7月8日專利技術者李榮秀, 李雪, 王一, 翟東改, 霍晨曦, 顏遠偉 申請人:上海交通大學本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種乳清蛋白的規模純化方法，其特征在于，通過以人α－乳清白蛋白重組牛乳為原料，經預處理純化蛋白后，用陰離子交換層析分離得到重組人α－乳清白蛋白、牛α－乳清白蛋白和牛β－乳球蛋白。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮秀，王一，翟東改，李雪，霍晨曦，顏遠偉，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：31