一種轉人類腫瘤抑制基因綠色熒光蛋白載體的培植方法技術

一種轉人類腫瘤抑制基因綠色熒光蛋白載體的培植方法，在GENBANK上參照人抗癌基因序列設計引物，采集肺癌早期病人外周血提取總RNA，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增P53片段，將該基因片段定向克隆到pMD18-T載體上面，構建出pMD18-P53重組質粒，通過PCR擴增、酶切和測序的方法對重組質粒進行鑒定，對pMD18-P53進行酶切鑒定提取P53目的基因定向的克隆到pEGFP-N1真核表達載體上，構建出pEGFP-N1-P53表達載體。本發明專利技術的有益效果是：利用安全穩定、復制力強、表達率高、易于檢測的真核表達載體pEGFP-N1作為人類抗癌基因的轉運載體，從而構建安全穩定、易于檢測、安全可靠的的真核表達載體pEGFP-N1-P53，從而用于預防和治療癌癥。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
１．一種轉人類腫瘤抑制基因綠色熒光蛋白載體的培植方法，其特征在于：培植的步驟如下：步驟一、設計引物，按照基因庫中人類腫瘤抑制基因序列，用生物學軟件ｐｒｉｍｅｒ５．０設計引物；步驟二、選擇肺癌早期病人外周血；步驟三、提取人外周血總ＲＮＡ和人類腫瘤抑制基因：１）從人外周血中提取的總ＲＮＡ，以總ＲＮＡ為模板，利用逆轉錄ＲＣＲ的方法提取人類腫瘤抑制基因；逆轉錄ＰＣＲ體系：在０．５ｍＬ離心管Ａ中加入配制的２５ｍｌ的逆轉錄ＰＣＲ緩沖液，２ｍｌ的人外周血總ＲＮＡ，５μＬ的５倍聚合酶鏈式反應緩沖液，濃度為２５ｍＭ的氯化鎂離子２μＬ，１μＬ的三磷酸脫氧核糖核苷ｄｅｏｘｙ－ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄＮＴＰ混合液，１μＬ的核糖核酸酶抑制劑ＲＮａｓｅ?。桑睿瑁椋猓椋簦铮?，１μＬ的禽骨髓母細胞增多性病毒反轉錄酶Ａｖｉａｎ　Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ?。郑椋颍酰蟆。遥澹觯澹颍螅濉。裕颍幔睿螅悖颍椋穑簦幔螅?，ＡＭＶ，１μＬ的優化的禽骨髓母細胞增多性病毒Ａｖｉａｎ?。停澹欤铮猓欤幔螅簦铮螅椋蟆。郑椋颍酰蟆。铮穑簦椋恚椋澹?，上游引物、下游引物各２μＬ，補加ＲＮＡ　去離子水至總體積為５０μＬ，混勻，表面添加一層石蠟油，形成逆轉錄ＲＴ－ＰＣＲ反應液，備用；反應程序為：（１）互補ＤＮＡ　　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?。模危?，ｃＤＮＡ的合成溫度為４０℃，合成時間為４０分鐘；（２）逆轉錄ＰＣＲ擴增：ＰＣＲ擴增共３０個循環，前５個循環，９４℃預變性３０秒、６５℃退火３０秒、７２℃延伸９０秒；后２５個循環，　９４℃變性３０秒；６８℃退火３０秒；７２℃延伸９０秒；（３）延伸：７２℃再次延伸１０分鐘；（４）形成逆轉錄ＰＣＲ產物；２）對逆轉錄ＰＣＲ產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行結果鑒定，備用；步驟四、利用常規ＰＣＲ的方法制備人類腫瘤抑制基因：利用ＰＣＲ反應制備出人類腫瘤抑制基因，對ＰＣＲ反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行結果鑒定，得到人類腫瘤抑制基因時，備用；步驟五、人類腫瘤抑制基因的回收與純化：對檢測過的人類腫瘤抑制基因利用ＧｅｎＣｌｅａｎ瓊脂糖凝膠ＤＮＡ回收試劑盒進行回收、純化，備用；步驟六、感受態細胞ＣａＣｌ２懸液的制備方法；步驟七、轉人類腫瘤抑制基因高效克隆聚合酶鏈式反應產物專用載體，ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ５３的構建：１）利用ｐＭＤ１８－Ｔ載體試劑盒對人類腫瘤抑制基因與高效克隆聚合酶鏈式反應產物專用載體ｐＭＤ１８－Ｔ載體的連接，連接反應體系：在０．２ｍＬ的離心管Ａ中加入４．５μＬ的人類腫瘤抑制基因，０．５μＬ的高效克隆聚合酶鏈式反應產物專用載體ｐＭＤ１８－Ｔ載體，５μＬ的Ｔ４?。模危吝B接酶，共１０μＬ體系，將三種溶液混合后，置于離心機內，５００轉／分鐘，離心１５秒，后置于１６°Ｃ干式恒溫儀內，連接１２小時，形成連接產物Ⅰ；２）將連接產物Ⅰ置于４°Ｃ條件下保存，備用；３）連接產物轉化：（１）取２００μＬ感受態細胞懸液，放入０．５ｍＬ離心管Ｂ內，后將０．５ｍＬ離心管Ａ置于　０℃的冰水混合物中，時間為１０分鐘，取出，形成感受態細胞懸液Ⅰ；（２）在０．５ｍＬ離心管Ｂ中加入１０μＬ的連接產物Ⅰ，混勻，０℃的冰水混合物中放置３０分鐘，形成混合液Ⅴ；（３）將含有混合液Ⅴ的０．５ｍＬ離心管Ｂ，放入４２℃的水浴鍋中熱激９０秒后，０℃的冰水混合物中放置１０分鐘，形成混合液Ⅵ；（４）在含有４００μＬ?。蹋乱后w培養基的１．５ｍｌ離心管Ａ中加入混合液Ⅵ，混勻，３７℃條件下培養１小時，形成混合菌液Ⅲ；（５）將含有混合菌液Ⅲ的１．５ｍｌ離心管Ａ放入離心機內，２０００轉／分鐘，離心３０秒，倒掉澄清液體，形成沉淀物Ⅳ，將其涂抹在含有卡那霉素、５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷５－Ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ　β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，Ｘ－Ｇａｌ、異丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷ＩＰＴＧ的ＬＢ固體培養基中，在３７℃條件，培養１２個小時，形成抗生素ＬＢ固體培養基；４）轉人類腫瘤抑制基因高效克隆聚合酶鏈式反應產物專用載體，ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ５３質粒提?。海ǎ保┰诳股兀蹋鹿腆w培養基中挑選白色單一菌落接種于５０ｍＬ的含卡那霉素的ＬＢ液體培養基中，３７℃，培養１６小時，備用，形成含有卡那霉素ＬＢ液體培養液Ａ；（２）?。保恚痰目敲顾兀蹋乱后w培養液Ａ移至１．５ｍＬ的離心管Ｂ中，放入離心機內，８０００轉／分鐘，離心５分鐘，棄去上層澄清液體；（３）重復步驟（２）一次，形成菌體Ⅰ；（４）在含有菌體Ⅰ的１．５ｍＬ離心管Ｂ中加入１００μＬ溶液Ⅰ，懸浮，形成懸浮菌液Ⅰ；（５）在含有懸浮菌液Ⅰ的１．５ｍＬ離心管Ｂ中加入２００μＬ新鮮配制的溶液Ⅱ，混勻，０℃的冰水混合物中靜置５分鐘，形成懸浮菌液Ⅱ；（６）在含有懸浮菌液Ⅱ的１．５ｍＬ離心管Ｂ中加入１５０μＬ溶液Ⅲ，混...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：雷雪芹，徐廷生，李振紅，張靜，韋光輝，索劍飛，張廣平，席守平，
申請(專利權)人：河南科技大學，
類型：發明
國別省市：41