本發(fā)明專利技術(shù)涉及檢測(cè)麻痹性貝毒的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種利用蛋白偶聯(lián)合成抗原，制備抗麻痹性貝毒的單克隆抗體，并涉及利用單克隆抗體與膝溝藻毒素GTX2/3抗原結(jié)合，而分析生物樣品中膝溝藻毒素GTX2/3含量的快速檢測(cè)試劑盒的制法。一種快速檢測(cè)麻痹性貝毒主要成分膝溝藻毒素GTX2/3的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括96孔酶標(biāo)板可拆板條、酶標(biāo)記二抗、含吐溫-20的緩沖鹽洗液、底物液和終止液，利用制得的含特異性抗膝溝藻毒素GTX2/3單克隆抗體，在96孔酶標(biāo)板上包被有合成的蛋白偶聯(lián)物的包被抗原。本發(fā)明專利技術(shù)試劑盒具有前處理簡(jiǎn)單、易操作，適于現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，該試劑盒的檢出限小于15ng/ml。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及檢測(cè)赤潮毒素的檢測(cè)器具，一種麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)的快速檢測(cè)試劑盒。特別是涉及一種利用蛋白偶聯(lián)合成抗原，制備抗麻痹性貝毒膝溝藻毒素GTX2/3的單克隆抗體，并涉及利用單克隆抗體與GTX2/3抗原結(jié)合，而分析檢測(cè)生物樣品中的麻痹性毒素含量的快速方便檢測(cè)試劑盒的制法。
技術(shù)介紹
赤潮災(zāi)害日益嚴(yán)重，已成為一種全球性的海洋生態(tài)災(zāi)害。赤潮是目前我國(guó)海洋環(huán)境中最嚴(yán)重的生態(tài)災(zāi)害之一。我國(guó)赤潮海域逐年擴(kuò)大，災(zāi)害逐年加重，每年因赤潮造成的經(jīng)濟(jì)損失非常巨大。赤潮生物通過(guò)分泌毒素，危害海洋動(dòng)物及人類健康，不但可導(dǎo)致海水增養(yǎng)殖魚蝦貝大量死亡；而且由于食用含有貝毒的魚蝦貝等海產(chǎn)品，可導(dǎo)致人體發(fā)生中毒，甚至死亡，從上世紀(jì)60年代至今，我國(guó)已發(fā)生赤潮毒素中毒人數(shù)650多人，死亡40多人。麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)是我國(guó)近岸海域最常見的赤潮生物毒素或貝毒之一，在近岸海域貝類體內(nèi)經(jīng)常檢出。Alexandrium tamarense等多種藻可以產(chǎn)生麻痹性貝毒。麻痹性貝毒(PSP)是一類具有四氫嘌呤結(jié)構(gòu)的化合物，呈堿性，易溶于水，在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定，堿性條件下發(fā)生氧化。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)此類化合物有20多種，根據(jù)R4基團(tuán)的不同可以分為四類，分別是①氨基甲酸脂類毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(neosaxiton，neoSTX)，膝溝藻毒素 GTX1、GTX2、GTX3、 GTX4 ；② N-磺酰氨甲酰基類毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 GTX5 (Bi)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3 和 C4 ；③脫氨甲酰基類毒素(decarbamoyl toxins)，包括 dcSTX、deneoSTX、 dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 ；④脫氧氨甲酰基類毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括 doSTX、doGTXldoGTX2。在這些化合物中，STX、neoSTX、GTXU GTX2、GTX3、GTX4 的毒性較大；dcSTX、deneoSTX、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 毒性較小；GTX5(B1)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3和C4毒性最小。麻痹性貝毒在全世界沿海都有分布，因赤潮生物種類及其地理分布不同，主要成分也不同，在溫帶海域最常見的毒素是GTX2、GTX3和STX，我國(guó)南方海域麻痹性赤潮毒素組份與此相似。麻痹性貝毒可在濾食性貝類體內(nèi)大量積累，貝類被人類食用后，會(huì)導(dǎo)致中毒，使人四肢面部肌肉麻痹、頭痛惡心，甚至窒息死亡。這類毒素主要作用于神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的鈉離子通道，阻斷鈉離子內(nèi)流，妨礙動(dòng)作電位的形成，因此表現(xiàn)出神經(jīng)中毒的特征。目前國(guó)際上普遍使用的麻痹性貝毒分析方法是生物小鼠法，用鹽酸在高溫下提取藻類或貝體中的麻痹性毒素，然后對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)小鼠的死亡時(shí)間判斷毒性大小。但是在提取過(guò)程中有可能導(dǎo)致貝毒化合物的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而改變毒性，同時(shí)用小鼠法測(cè)定貝毒含量存在誤差大、重現(xiàn)性差，可比性低的缺點(diǎn)。高效液相色譜技術(shù)(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是目前分析鑒定麻痹性貝毒的準(zhǔn)確有效方法，其原理是PSP毒素在堿性條件下氧化生成熒光物質(zhì)，進(jìn)行熒光檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是儀器及分析試劑昂貴、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏，樣品前期處理麻煩，操作復(fù)雜，難以現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。目前國(guó)際普遍流行的簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的貝毒檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbantassay, ELISA)，其優(yōu)點(diǎn)是樣品前處理簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，靈敏度較高，方便迅速，能大批量檢測(cè)樣品，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。其原理是抗體高度特異地與抗原分子結(jié)合，通過(guò)抗原-抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，既能定性又能定量，具有靈敏、簡(jiǎn)單和專一的特點(diǎn)。在多肽激素、 腫瘤標(biāo)記、細(xì)胞因子、藥物監(jiān)控化合物、傳播抗原等領(lǐng)域，得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，我國(guó)每年均有在貝中檢測(cè)出麻痹性貝毒的報(bào)道，時(shí)有中毒及死亡的事件發(fā)生，已嚴(yán)重的影響了貝類進(jìn)出口貿(mào)易發(fā)展，引起各級(jí)政府及消費(fèi)者的極大關(guān)注。建立麻痹性貝毒的快速靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品，對(duì)確保海產(chǎn)品食用安全及維持貝類養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有十分重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服上述麻痹性貝毒檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種特異、敏感和簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)麻痹性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；提供一種抗麻痹性貝毒單克隆抗體的制備，并利用抗麻痹性貝毒單克隆抗體研制的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析膝溝藻毒素GTX2/3的試劑盒，簡(jiǎn)單易操作，適于現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的分析檢測(cè)。本專利技術(shù)為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種快速檢測(cè)麻痹性貝毒的快速酶聯(lián)免疫試劑盒，包括使用甲醛連接法，按一定反應(yīng)比例將石房蛤毒素STX偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白 (KLH)上，經(jīng)透析提純偶聯(lián)物，用150μ g加佐劑充分乳化，腹腔注射免疫BALB/C鼠，加強(qiáng)免疫數(shù)次后，取免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，陽(yáng)性檢測(cè)、克隆篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)及誘生腹水制得抗麻痹性貝毒主要組分膝溝藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的單克隆抗體； 用合成的STX-卵清蛋白(STX-OVA)包被96孔酶標(biāo)板，加入GTX2/3標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入稀釋的單克隆抗體Mab-PSP，包被抗原中的GTX2/3與自由的GTX2/3競(jìng)爭(zhēng)抗體Mab-PSP，自由的GTX2/3和抗體復(fù)合物被洗去，與包被抗原STX結(jié)合的抗體STX-Mab-PSP再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，經(jīng)底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，樣品中自由的GTX2/3含量越少，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程或曲線，計(jì)算樣品中GTX2/3的含量。本技術(shù)專利技術(shù)的有益效果是利用制得的含特異性抗GTX2/3或STX的單克隆抗體， 所研制的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，該試劑盒的檢出限小于15ng/ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下突出優(yōu)點(diǎn)本專利技術(shù)的檢測(cè)麻痹性貝毒膝溝藻毒素GTX2/3的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高(可達(dá)15ng/ml)，檢測(cè)快速，前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單易掌握等優(yōu)點(diǎn)。麻痹性貝毒的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括已包被有包被抗原的可拆96孔酶標(biāo)板 (8孔X 12條)、洗液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、底物溶液、抗麻痹性貝毒的單克隆抗體；96孔可拆酶標(biāo)板板條上預(yù)先包被有合成的包被抗原(麻痹性貝毒半抗原與蛋白偶聯(lián)物)。所述抗麻痹性貝毒的單克隆抗體為用石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/c 小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗麻痹性貝毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系分泌的。所述試劑盒為檢測(cè)麻痹性貝毒的主要成分膝溝藻毒素GTX2/3的試劑盒。所述快速檢測(cè)麻痹性貝毒膝溝藻毒素GTX2/3的酶聯(lián)免疫試劑盒的制法，其步驟包括1、將石房蛤毒素與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到石房蛤毒素-載體蛋白偶聯(lián)物；2、用石房蛤毒素-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌抗膝溝藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種分泌特異性單克隆抗體的融合細(xì)胞株。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁玉波，劉仁沿，許道艷，劉磊，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：91
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