本發(fā)明專利技術(shù)公開一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法，是通過設(shè)計(jì)特異性片段擴(kuò)增和RACE擴(kuò)增的方法，從雙齒圍沙蠶體壁肌肉總RNA中克隆得到了雙齒圍沙蠶的金屬結(jié)合蛋白基因，可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)雙齒圍沙蠶在受到重金屬等污染物脅迫下MPⅡ基因表達(dá)的規(guī)律，為探討重金屬對(duì)雙齒圍沙蠶MPⅡ基因調(diào)控的作用機(jī)理提供依據(jù)，亦為篩選海洋沉積環(huán)境污染早期生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的分子生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)，利于成本低、來源豐富的雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因的克隆方法。
技術(shù)介紹
多毛類隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門，是廣泛分布于海洋近岸和河口潮灘的優(yōu)勢(shì)底棲動(dòng)物， 也是海洋生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。由于其具有體型大、生命周期長、行動(dòng)緩慢、分布廣泛，對(duì)許多持久性污染物具有較強(qiáng)的耐受性和生物利用性，因此一直作為海洋沉積環(huán)境污染評(píng)價(jià)的指示生物和毒理研究的模型動(dòng)物。如Bryan等發(fā)現(xiàn)雜色沙蠶i^ereis diversicolor)暴露于Cd2+192 h LC50達(dá)到100 mg/L，遠(yuǎn)超過一般海洋無脊椎動(dòng)物的耐受范圍(0. 1 10mg/L)。有研究表明，在沉積環(huán)境中，雜色沙蠶對(duì)鋅和鎘的耐受濃度分別可達(dá)到100 3000 μ g/g和0. 2 9. 3 μ g/g，體內(nèi)蓄積量亦可分別達(dá)到130 350 μ g/g和 0. 08 3. 6 μ g/g ο許多資料證實(shí)，幾乎所有脊椎動(dòng)物和大多數(shù)無脊椎動(dòng)物，經(jīng)重金屬誘導(dǎo)后均能合成大量金屬硫蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、重金屬解毒以及清除自由基等生物學(xué)功能。多毛類雜色沙蠶暴露于鎘后可形成金屬結(jié)合蛋白，分析表明，其是類似于血紅蛋白 (hemerythrin, Hr)或肌紅蛋白(myohemerythrin，Mhr)家族的呼吸蛋白，稱為MP II，主要承擔(dān)長期慢性重金屬暴露條件下的解毒作用，研究表明金屬結(jié)合蛋白不僅能夠與鎘相結(jié)合，還具有與鋅和銅結(jié)合的能力，具有明顯的抗菌活性。雙齒圍沙蠶iPerinereis aibuhitensis)在遼東灣潮間帶底棲生物中為優(yōu)勢(shì)種， 其金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中已有記載，該基因cDNA的序列全長 904個(gè)堿基，其中閱讀框?yàn)?57個(gè)堿基，編碼119個(gè)氨基酸，3’端非翻譯區(qū)為463個(gè)堿基，5’ 端非翻譯區(qū)有81個(gè)堿基。所記載的序列如下1ccaactgagtttaatcactaacttgagaaagcaattttaactttgtgactcgagttcagc61gcagctcagcacaccttcaagatgggttacgatattcctgaaccattcaagtgggacgag121tccttcaaggtcttctatgacatgctcgatgatgagcacaagcagatcttcaacgccatc181ttcgatgtctgcggtggaaacaacgctaacaacctcaagaagatgatcgaagttactgcc241aaccacttcaaggatgaggagggcatgatggtctctgccaagtatgccgacttcgactcc301cacaagaagaagcacgaggacttcttggccgtcatccgtggcctctctgctcccgtcccc361gacgacaagatcaagtacgccaaggaatggctcgtcaaccacatcaagggaaccgacttc421cagtacaagggcaagttgtaaacagcgcgccatgacgcaaagtgccacctagctgttagt481gtcgtttcagcgggcgagagtgacgctcctggtggtcaacagcaaaactaCgtgtCgttg541tgtgcaaaatgaatgactgtccctgttagtcagttgtcgtcaccctacgcagcgttttct601acacctggcagcttcgtgttaatttctcagccgattagtattaagaacttgccaagatta661tgagcaaaaactactcgcagaaaaactcatcaaaattcacggacagtttccttaagatca721gacaaaataagatcattataaacaggaccttaacatctggtgtcctttgtcacacttaag781 gtattatttc tctcgtcaat cacatcctaa caatgcaatg tatatattct acattgatta 841 attttggaat ttgtgaatct tgtgtgttac attttaataa actctgcttt tctaaaaaaa 901 aaaa 氨基酸序列描述MGYDIPEPFKWDESFKVFYDMLDDEHKQIFNAIFDVCGGNNANNLKKMIEVTANHFKDEEGMMVSAKYADFDS HKKKHEDFLAVIRGLSAPVPDDKIKYAKEWLVNHIKGTDFQYKGKL迄今為止，關(guān)于雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白(MP II)的研究主要還是集中于其蛋白水平的檢測(cè)和分析，還未有克隆基因的報(bào)道，以至于無法深入研究其功能特征、調(diào)節(jié)機(jī)理等，影響了雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護(hù)中的廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種雙齒圍沙蠶。本專利技術(shù)的技術(shù)解決方案是一種，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；b.應(yīng)用一對(duì)引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增 所述正向引物 5 ‘ -CGAGTCCTTCCAGGTCTTC-3 ‘，所述反向引物 5 ‘ -TCGGTCTTCTTCTTGTGGG-3 ‘；c.應(yīng)用5' RACE PCR引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行5' RACE擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列；所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CTTGAGGTTGTTAGCGTTGTTTC-3 ‘；d.應(yīng)用3' RACE PCR引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行3' RACE擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶cDNA3 ‘端序列；所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -TGGAAACAACGCTAACAACCTCA-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC-3 ‘；e.將雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列與雙齒圍沙蠶cDNA3‘端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因。本專利技術(shù)首次從雙齒圍沙蠶中克隆到金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因，可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)雙齒圍沙蠶在受到重金屬等污染物脅迫下MP II基因表達(dá)的規(guī)律，為探討重金屬對(duì)雙齒圍沙蠶MP II基因調(diào)控的作用機(jī)理提供依據(jù)，亦為篩選海洋沉積環(huán)境污染早期生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的分子生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)，利于成本低、來源豐富的雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用。附圖說明圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例雙齒圍沙蠶總RNA純化后的電泳圖。圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例雙齒圍沙蠶MP II cDNA部分片段的擴(kuò)增電泳圖。圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例雙齒圍沙蠶MP II 3'端快速擴(kuò)增片段的電泳圖。圖4為本專利技術(shù)實(shí)施例雙齒圍沙蠶MP II 5'端快速擴(kuò)增片段的電泳圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 如下 一.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；1.總RNA的提取及純化利用hvitrogen公司的Trizol。所提取及純化后的總RNA 電泳圖如圖1所示。其中，M為分子量標(biāo)記，1-2為純化后的總RNA。2. cDNA 第一鏈合成本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行：ａ． 提取及純化雙齒圍沙蠶總ＲＮＡ，合成ｃＤＮＡ第一鏈；ｂ． 應(yīng)用一對(duì)引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)雙齒圍沙蠶ｃＤＮＡ第一鏈進(jìn)行擴(kuò)增：所述正向引物５′－ＣＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣ－３′，所述反向引物５′－ＴＣＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＧ－３′；ｃ． 應(yīng)用５′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行５′ ＲＡＣＥ擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶ｃＤＮＡ５′端序列；所述５′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ正向引物：５′－ＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡ－３′；所述５′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ反向引物：５′－ＣＴＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＡＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣ－３′；ｄ． 應(yīng)用３′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ引物對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行３′ ＲＡＣＥ擴(kuò)增，得到雙齒圍沙蠶ｃＤＮＡ３′端序列；所述３′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ正向引物：５′－ＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡ－３′；所述３′ ＲＡＣＥ ＰＣＲ反向引物：５′－ＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣ－３′；ｅ． 將雙齒圍沙蠶ｃＤＮＡ５′端序列與雙齒圍沙蠶ｃＤＮＡ３′端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因。...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周一兵，楊大佐，何潔，王斌，陳雪，趙歡，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：大連海洋大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：91
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。