一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法技術

本發明專利技術屬生物化學領域，具體涉及一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法。本發明專利技術公開了一種抗菌脂肽，其序列為Octanoly(C8)-KKKWPW及其衍生物或活性片段，其具有廣泛的抗菌活性，并具有較低的溶血性。該抗菌脂肽或其衍生物或與多種載體混合，制成注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、黏膜吸收劑等用于臨床，也可作為抗菌制劑應用于食品、化妝品等。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生物化學領域，具體涉及。
技術介紹
抗生素自被發現以來就成為人類與感染性疾病進行斗爭的有利武器。抗生素的發現和進入臨床應用，拯救了千千萬萬受病菌感染病人的生命。近年來，由于環境和人為因素導致耐藥菌不斷產生，甚至出現了能抵抗大多數可用抗菌素的超級細菌。嚴重降低了普及型抗生素的治療效果，給感染性疾病的控制和治療帶來了極大的困難，同時也給人類的健康帶來了潛在的威脅(饒賢才，2004)。新型抗生素因此成為當今藥物研究領域中日益受到重視的方向之一。抗菌肽廣義上是指存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害、消除體內突變細胞的一類小分子多肽。7 0年代末，研究者從昆蟲體內發現了抗菌肽，也稱為肽類抗生素，是生物體內經誘導產生的一類具有生物活性的小分子多肽。后來，人們陸續從細菌，真菌，昆蟲， 被囊類動物，兩棲類動物，鳥類，魚類，哺乳類以及人類中分離出1500多種陽離子抗菌肽。 這些從生物體中分離出來抗菌肽是組成生物體非特異性防御系統的重要組分，能夠有效的作用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒以及癌細胞。來自自然界的抗菌肽具有來源廣泛、結構多樣、活性確切等優點，但它們大多數具有分子量較大、易于代謝失活、具有抗原性或者具有一定的毒性、天然提取工藝復雜、天然資源有限等等缺點，真正將天然抗菌肽推向市場可能還要面臨很多挑戰。因此，通過研究分析天然抗菌肽的特點，了解其結構功能，分析序列特點，對這些活性先導物進行結構改造或是以其為藍本進行全新設計及合成的化學合成抗菌肽為解決這一難題提供了有效途徑，具有重要的意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種能夠抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌生長的抗菌脂肽。并提供一種工藝簡化、成本降低、工時減少、操作安全的脂肽固相合成方法。本專利技術的另一個目的是提供上述抗菌脂肽的化學合成方法。本專利技術的另一個目的是提供上述抗菌脂肽及其活性片段在制備抗菌藥物中的應用。本專利技術的抗菌脂肽，其序列為Octanoly (C8)-KKKWPW。本專利技術的抗菌脂肽采用化學合成法合成，可以是液相合成，也可以是固相合成。本專利技術篩選得到的抗菌脂肽可廣泛地對抗已具有抗藥性的菌株及醫藥上重要的真菌。本專利技術的抗菌脂肽對于人的紅血球有非常低的溶血性。本專利技術還提供了一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法。(1)稱取適量Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂置于固相反應器中，用大約2. 5倍體積的DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)洗滌樹脂兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器反應5 min，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑反應 10 min，用真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌樹脂兩次，接著用茚三酮法檢測至樹脂成黑色或紫色。然后樹脂用DMF潤洗一次，加入Fmoc-Trp (Boc) -OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌，取少量樹脂用茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(2)在步驟(1)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min,抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(3)在步驟( 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc- Trp (Boc) -OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體， 在室溫下反應40 min,抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(4)在步驟C3)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys (Boc) _0H、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體， 在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(5)在步驟(4)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys (Boc) _0H、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體， 在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(6)在步驟( 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys (Boc) _0H、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體， 在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。(7)在步驟(6)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入正辛酸、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。用DCM重新洗滌兩次， 樹脂真空干燥。(8)把干燥后的樹脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降溫，加入切割試劑(81. 5% TFA+l%TIS+5%DIffater +2. 5%EDT +5%苯甲硫醚+5%苯酚)攪拌反應10 min后室溫攪拌3-4 h。過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，乙醚洗滌，得到的固體減壓抽干，即得粗品。粗品經制備HPLC純化，冷凍干燥，得到純品。3、根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于脫帽試劑組分和體積比為哌啶=DMF=I 4 ；Fmoc-Trp (Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2_4倍；HBTU 的摩爾數為樹脂的2-4倍；DIEA的摩爾數為樹脂的2-6倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；Fmoc- Lys (Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；Fmoc- Wie-OH的摩爾數為樹脂的 2-4倍；正辛酸的摩爾數為樹脂的2-4倍。4、根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于=Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5_15 mL/g ；Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂的重量與DMF的加入量的比例為5-12 mL/g ；Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂的重量與DMF、無水甲醇、DCM的加入量的比例為5-12 mL/g。5、根據權利要求1所述抗菌脂肽在制備抗菌藥物中的應用。6、根據權利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于其衍生物或活性片段包含權利要求1所述的氨基酸序列或片段。7、根據權利要求1所述的脂肽可以應用于食品、化妝品，可以與藥學上可接受的載體混合，制成注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、黏膜吸收劑等。附圖說明圖1為本專利技術抗菌脂肽Octanoly (C8)-KKKWPW對人的紅血球的低溶血性實驗結果。具體的實施方式實施例1 稱取15g Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂置于250ml固相反應器中，用大120ml 的DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入IOOml DMF(N，N-二甲基甲酰胺)洗滌樹脂兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種低溶血性抗菌脂肽，其特征在于：其序列為Ｏｃｔａｎｏｌｙ（Ｃ８）－ＫＫＫＷＰＷ。

【技術特征摘要】
1.一種低溶血性抗菌脂肽，其特征在于其序列為Octanoly (C8)-KKKWPW。2.一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于(1)稱取適量FmocRink-Amide MBHA樹脂置于固相反應器中，用大約2. 5倍體積的 DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)洗滌樹脂兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器反應5 min，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑反應10 min，用真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌樹脂兩次，接著用茚三酮法檢測至樹脂成黑色或紫色；然后樹脂用DMF潤洗一次，加入Fmoc-Trp (Boc) -OH, DMF, DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌，取少量樹脂用茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；(2)在步驟(1)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5min,抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；(3)在步驟( 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc- Trp (Boc) -OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；(4)在步驟C3)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys (Boc) _OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；(5)在步驟(4)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5min，抽干，重新加入脫帽劑反應10 min,抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys (Boc) _OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；(6)在步驟( 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5min，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙春暉，賴宏森，
申請(專利權)人：大連伊美生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：91