本發明專利技術公開了一種高效表達重組人凝血因子VII的方法及其專用載體。該載體自上游至下游順次包含人延伸因子1α亞基啟動子EF-1α或巨細胞病毒即刻早期啟動子CMV-IE，人凝血因子VII的cDNA基因，人工合成的內含子，內部核糖體進入位點IRES，谷氨酰胺合成酶基因GS或二氫葉酸還原酶基因DHFR，牛生長激素poly?A信號序列和質粒的復制結構域。對表達樣品的檢測結果證明，轉染有本發明專利技術4種重組載體的CHO細胞能穩定、高效表達重組人凝血因子VII，平均表達量約為5-13mg/L，而且表達樣品具有較高的促凝活性，表達產物能縮短血漿的凝血時間，通過活性計算，活性最高者相當于524％血漿FVII的活性。本發明專利技術將在重組人凝血因子VII的高效表達中發揮重要作用，應用前景廣闊。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
中蛋白的重組表達方法，特別是涉及一種高效表達重組人凝血因子VII的方法及其專用載體。
技術介紹
凝血過程是機體的重要保護機制之一，是一系列凝血因子相繼酶解激活的過程， 最終結果是凝血酶和纖維蛋白凝塊的形成。這一過程包括內源性凝血途徑和外源性凝血途徑，這兩條途徑的主要區別是啟動方式和參加的凝血因子不完全相同，但參與兩條凝血途徑的某些凝血因子能夠相互激活，將兩條途徑聯系起來。其中，凝血因子VII發揮了重要作用。凝血因子VII (coagulation factor VII，FVII)是形成凝血塊起始的關鍵分子之一，在凝血過程中發揮著極其重要的作用。它主要通過與暴露的組織因子(tissue factor, TF)結合，形成TF-FVII復合物而啟動外源性凝血途徑，同時對內源性凝血途徑的啟動也具有特殊的調控作用。人FVII主要由肝臟合成，是一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員。其基因含9個外顯子，全長12.81Λ，定位于染色體13q34。人FVII的 cDNA (GenBank號匪019616)由1335bp組成，編碼406個氨基酸殘基，分子量約為 45. 5kDa,經過翻譯后修飾，加上側鏈的糖基，分子量可達50kDa。人血漿中FVII主要以酶原形式存在，而活性形式的FVII含量僅占約1%。當FVII 的Argl52-Ilel53之間的肽鍵裂解后，由單肽鏈形式轉變為雙肽鏈形式，即形成有酶活性的FVIIa。其中1-152位的氨基酸殘基組成FVIIa的輕鏈，分子量為20kDa;153-406位的殘基組成FVIIa的重鏈，分子量為30kDa。輕鏈與重鏈由原第135位和262位氨基酸殘基之間的單個二硫鍵連接。輕鏈始端約38個氨基酸殘基構成Y-羧基谷氨酸區，亦稱“Gla” 區，其后有兩段氨基酸殘基的排列順序與上皮生長因子相似的區域，稱為“EGF”區；重鏈部分氨基酸殘基的排列順序與絲氨酸蛋白酶家族有顯著同源性，是FVIIa具有催化作用的功能區，稱為絲氨酸蛋白酶區。FVII在合成過程中所經歷的翻譯后修飾包括Asnl45和Asn322的N-糖基化， Ser52和Ser60的0_糖基化以及Gla區內多處谷氨酸殘基(第6、7、14、16、19、20、25、26、 四、35位)的Y-羧基化。在正常生理條件下，人體內只有大約1 %的FVII具有酶活性，而血漿中FVII的水平非常的低，應用放免法測定大約為200-400ng/mL，而且隨個體和人種有比較大的波動。人 FVII 的半衰期非常短，GE Rivard 等(Rivard GE, Kovac I，Kunschak M, et al. Clinical study of recovery and half-life of vapor-heated factor VII concentrate. Transfusion. 1994,34(11) :975-981.)證明FVII在血漿中的半衰期大約在5小時到7小時之間。重組人凝血因子VII是指應用基因工程的方法將人FVII的cDNA基因導入哺乳動物細胞中進行體外表達，從而獲得重組凝血因子VII。Thim L 等(Thim L, Bjoern S, Christensen M.Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor Vila from plasma and transfected baby hamster kidney cells. Biochemistry. 1988, 27 :7785-7791.)比較了人FVII重組樣品(rFVIIa)與血漿純化樣品(pd-FVIIa)的區別，發現兩者的氨基酸序列完全相同，均與cDNA推測的結果一致，并且在N端均有一段長達60個氨基酸殘基的信號肽序列。然而，兩者在翻譯后的修飾方面存在較大區別①Y-羧基化比較兩者Gla區谷氨酸Y-羧基化發現，在PdFVHa中，所有10個可能的Gla殘基全部Y -羧基化，而rFVIIa只有9個Gla殘基完全Y-羧基化，1個部分Y-羧基化。但這個差別與功能似乎并無聯系。 ②0-糖基化pd-FVII含兩個0-糖基化位點Ser52和kr60。在rFVIIa中也發現了這兩個位點。Ser52有三種不同的葡聚糖結構葡萄糖單體、葡萄糖-木糖和葡萄糖_(木糖)2。 這三種結構在兩種蛋白樣品中的數量稍有不同。在義計。位點，兩者都發現了巖藻糖。位點特異性突變研究發現，0-糖基化與FVII同TF的結合有關。③N-糖基化兩者都發現在 Asnl45和Ash322完全N-糖基化，區別是rFVIIa具有比較高的巖藻糖含量和較低的唾液酸含量。盡管存在結構上的不同點，HednerU 等(Hedner U, Ljundberg J, Lund-Hansen T. Comparison of the effect of plasma-derived and recombinant human FVIIa in vitro and in a rabbit model. Blood Coagul Fibrinolysis. 1990,1(2) :145-153.)證明， 兩者的生物學功能是完全一樣的。重組產品的作用機制與人體內的正常凝血機制稍有不同。體外實驗證明，rFVIIa 會和FVII競爭TF受體。大劑量注射rFVIIa后，在啟動凝血瀑布階段，血漿高水平的rFVIIa 克服了 FVII的干擾，使TF與rFVIIa飽和，從而確保其發揮最大的生理作用，產生足夠的活化血小板。在放大階段，rFVIIa與血小板低親和，并且不依賴TF產生FXa，因而比pd_FVII 更加有效。低親和性說明了治療中rFVIIa高劑量的必要性。rFVIIa不與休眠的血小板結合，因而只有當發生損傷，TF暴露并且血小板被活化后才可以發揮凝血作用。由于血漿中FVII含量比較少，純化比較困難，對其適應癥的研究僅限于FVII缺乏癥。后來隨著基因工程技術的發展，rhFVII成為了帶抑制物的血友病人的主要替代療法。 最近的臨床研究表明，FVII對血小板減少癥和血小板功能障礙、嚴重創傷、大面積外科手術的止血具有令人滿意的治療效果。目前，其主要的臨床適應癥包括帶有凝血因子VIII抑制劑的血友病人、凝血酶產生障礙的病人、外科手術和嚴重創傷引發的大出血、先天性和獲得性FVII缺陷等。
技術實現思路
本專利技術的目的是通過表達元件的優化，構建新型的重組人凝血因子VII表達載體，并建立完善的表達體系，利用加壓篩選的方法使篩選基因獲得擴增，該篩選基因加壓擴增的同時又可以帶動其側翼目的基因的拷貝數增加，從而實現重組人FVII在哺乳動物細胞中的高效表達。為解決上述技術問題，本專利技術采取以下技術方案一種用于高效表達重組人凝血因子VII的專用載體，自上游至下游順次包含以下表達元件51)啟動子，選用人延伸因子Ia亞基啟動子(EF-Ia)或巨細胞病毒即刻早期啟動子(CMV-IE)，優選為EF-I α啟動子，該啟動子不受細胞周期的限制，可以在細胞高密度培養時，持續地使目的基因表達；2)人凝血因子VII的cDNA基因；3) pI本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種用于高效表達重組人凝血因子ＶＩＩ的專用載體，包含自上游至下游順次排列的以下表達元件：１）啟動子，選用人延伸因子１α亞基啟動子（ＥＦ－１α）或巨細胞病毒即刻早期啟動子（ＣＭＶ－ＩＥ），優選為ＥＦ－１α啟動子；２）人凝血因子ＶＩＩ的ｃＤＮＡ基因；３）ｐＩＲＥＳｎｅｏ載體中的人工合成的內含子序列（ＩＶＳ）；４）內部核糖體進入位點（ＩＲＥＳ）；５）篩選基因，選用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）或二氫葉酸還原酶基因（ＤＨＦＲ），優選為ＧＳ基因；６）牛生長激素ｐｏｌｙ?。列盘栃蛄校唬罚┵|粒的復制結構域。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：呂茂民，章金剛，王卓，馮晶晶，唐倩，趙雄，馬玉媛，尹惠瓊，楊姝，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所，
類型：發明
國別省市：11
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