本發明專利技術公開了一種檢測氯霉素的免疫層析試紙及其制備方法。本發明專利技術提供的檢測氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有氯霉素抗原，所述質控線含有能與所述氯霉素抗體特異結合的抗抗體。本發明專利技術的實驗證明，用本發明專利技術提供的試紙檢測氯霉素，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現客觀化測定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及氯霉素殘留物的檢測試劑，具體涉及。
技術介紹
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是一種有效的廣譜抗生素，常用于動物各種傳染性疾病的治療，對多種病原菌有較強的抑制作用，曾在水產養殖業中得到廣泛應用，同時也帶來了水產品中氯霉素殘留的嚴重問題。氯霉素由于存在嚴重毒副作用，已被許多國家和地區列為禁用藥物。歐盟、美國等均在法規中規定CAP殘留限量標準為“零容許量”，即不得檢出。我國是一個水產養殖大國，養殖規模不斷擴大，但養殖過程中濫用抗生素，已成為一個嚴重的水產品安全問題。為此我國在《動物性食品獸藥殘留規定》中規定可食部分不得檢出，并且在出口的日常檢測中，將其列為必檢項目，一旦發現超標，一律禁止出口。目前現場篩查用檢測試劑多用氯霉素膠體金試紙進行檢測，但因其靈敏度低不能很好滿足要求， 因此需要開發可在現場更為準確和快速的檢測方法。基于抗原-抗體免疫學反應的側流免疫層析檢測技術(LFIAs)是20世紀90年代初發展起來的新興技術，因其快捷方便的特性，非常適宜用于現場的快速監測。但目前該類技術多采用膠體金作為信號標記分子，受其靈敏度等的限制，只能用于定性檢測。超順磁性復合粒子具有良好的磁學特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質的生物樣品的檢測。膠體金和熒光標記分子用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區膜表面觀測到約10%的信號分子強度，而用超順磁性復合粒子作為標記材料，則可檢測到檢測區膜三維立體結構中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應的磁信號檢測儀達到定量測定，因此，超順磁性復合粒子是近年來在LFIAs中受到關注的材料。然而，目前報道的生物檢測用磁性納米復合粒子多采用化學法如共沉淀法先制備得到有機相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進行穩定化包覆修飾，以得到穩定的、水溶性的磁性標記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復雜，得到的超順磁性復合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強度、外磁場響應速度、穩定性和標記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復合粒子在LFIAs中的應用。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種檢測氯霉素的免疫層析試紙。本專利技術提供的檢測氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有氯霉素抗原，所述質控線含有能與所述氯霉素抗體特異結合的抗抗體。所述反應墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體為將氯霉素抗體和超順磁性復合粒子的以肽鍵共價結合形成的聚合體；所述氯霉素抗體為氯霉素單克隆抗體或氯霉素多克隆抗體，所述氯霉素抗體具體為氯霉素單克隆抗體(云南大學單克隆抗體工程技術中心，CAP-001)；所述氯霉素抗原為氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物；小分子抗原物質與載體蛋白偶聯時，每個載體蛋白分子上所連接的半抗原的平均數目稱為偶聯比或結合比。為達到載體蛋白與NC膜的良好結合，同時又能最大程度地保證氯霉素半抗原空間位點的延展，選擇合適的偶聯比是非常重要的。偶聯比的大小與半抗原功能基團的活性、位阻、反應投料比及反應條件有關。一般通過調節半抗原與載體的摩爾比、反應環境PH值、溫度、離子強度等來控制偶聯比。所述載體蛋白與所述氯霉素半抗原的偶聯比為1 8 1 10，適于抗原的包被和氯霉素半抗原空間位點的延展，所述載體蛋白與所述氯霉素半抗原的偶聯比具體為 1 10 ；所述與所述氯霉素抗體特異結合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述氯霉素抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。所述超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U. 15mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調pH至4. 7)混勻，反應，得到活化后磁性粒子；2)將每2. 5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg氯霉素抗體和0. 8ml濃度為 50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應，得到含有偶聯后磁性粒子的反應液；3)向步驟2)得到的反應液中加入BSA混勻得到混合液、反應，得到含有封閉后磁性粒子的反應液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質量百分含量)。所述氯霉素抗原按照如下方法制備A)將每50mg氯霉素半抗原、Iml無水乙醇、鋅粉混勻，反應，得到反應液a ；B)將步驟A)得到的反應液a離心取上清液，每Iml上清液(逐滴)加入ISOul濃度為1. 45mol/L的NaNO2水溶液，反應，得到溶液b ；C)將每400mg載體蛋白和IOml濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液混合， 得到溶液c ；D)將每Iml步驟B)得到的溶液b和IOml步驟C)得到的溶液c混勻，反應，得到反應液do所述超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的制備方法中步驟1)中，反應溫度為37°C，反應時間為0. 5h ；步驟2)中，反應溫度為25°C，反應時間為3. 5h ；步驟3)中，反應溫度為37°C，反應時間為0.證。所述氯霉素抗原的制備方法中步驟A)中，反應溫度為65°C，反應時間為40分鐘；反應的pH值為1 ；步驟B)中，反應時間為池；反應溫度為4°C，反應pH值為1 ；離心的時間為IOmiru 離心的離心力為4000g，離心的溫度為4°C ；步驟C)中，所述反應的溫度為4°C，所述反應的時間為6h，所述反應的pH值為 8. 5。所述超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液；所述氯霉素抗原的制備方法中，在所述步驟D)后還包括如下步驟E)將步驟D)得到的反應液d透析、凍干，得到氯霉素抗原；所述透析采用的透析液為濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，透析時間為 48h，每12h更換一次透析液。所述氯霉素半抗原為氯霉素；所述載體蛋白為BSA;由于氯霉素是小分子物質，其分子表面特性不利于與反應區即NC膜的直接結合，需要將其與載體蛋白進行偶聯后才能借助于載體蛋白的表面特性而達成與NC膜的良好結合。可用作載體蛋白的有各種動物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)，還有鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纖維蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
抗體特異結合的抗抗體。１．一種檢測氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有氯霉素抗原，所述質控線含有能與所述氯霉素
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬嵐，盧體康，秦智鋒，袁航，吳峰，
申請(專利權)人：清華大學深圳研究生院，
類型：發明
國別省市：94
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