一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙及其制備方法。本發明專利技術提供的檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。本發明專利技術的實驗證明，用本發明專利技術提供的試紙檢測孔雀石綠，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現客觀化測定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及孔雀石綠殘留物的檢測試劑，具體涉及。
技術介紹
孔雀石綠(malachite green, MG)又名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠，苯胺綠、維多利亞綠或中國綠等，屬三苯甲烷類染料，曾被廣泛用于預防和治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。但孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠在水產品體內會產生高殘留。 人食用后易引起致癌、致畸和致突變等副作用。歐盟、美國以及部分東亞國家均已禁止將孔雀石綠用作漁類的抗真菌藥物，我國于2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。我國是水產品生產、消費和出口大國，孔雀石綠是近幾年對水產品主要監控的藥殘之一。目前現場篩查用檢測試劑多用孔雀石綠膠體金試紙進行檢測，但因其靈敏度低不能很好滿足要求，因此需要開發可在現場更為準確和快速的檢測方法。基于抗原-抗體免疫學反應的側流免疫層析檢測技術(LFIAs)是20世紀90年代初發展起來的新興技術，因其快捷方便的特性，非常適宜用于現場的快速監測。但目前該類技術多采用膠體金作為信號標記分子，受其靈敏度等的限制，只能用于定性檢測。超順磁性復合粒子具有良好的磁學特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質的生物樣品的檢測。膠體金和熒光標記分子用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區膜表面觀測到約10%的信號分子強度，而用超順磁性復合粒子作為標記材料，則可檢測到檢測區膜三維立體結構中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應的磁信號檢測儀達到定量測定，因此，超順磁性復合粒子是近年來在LFIAs中受到關注的材料。然而，目前報道的生物檢測用磁性納米復合粒子多采用化學法如共沉淀法先制備得到有機相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進行穩定化包覆修飾，以得到穩定的、水溶性的磁性標記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復雜，得到的超順磁性復合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強度、外磁場響應速度、穩定性和標記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復合粒子在LFIAs中的應用。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙。本專利技術提供的檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。所述反應墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體為將孔雀石綠抗體和超順磁性復合粒子的以肽鍵共價結合形成的聚合體；所述孔雀石綠抗體為孔雀石綠單克隆抗體或孔雀石綠多克隆抗體，所述孔雀石綠抗體具體為孔雀石綠單克隆抗體(北京邁克隆興生物技術有限公司，0010)；所述孔雀石綠抗原為孔雀石綠半抗原與載體蛋白的偶聯物；小分子抗原物質與載體蛋白偶聯時，每個載體蛋白分子上所連接的半抗原的平均數目稱為偶聯比或結合比。為達到載體蛋白與NC膜的良好結合，同時又能最大程度地保證孔雀石綠半抗原空間位點的延展，選擇合適的偶聯比是非常重要的。偶聯比的大小與半抗原功能基團的活性、位阻、反應投料比及反應條件有關。一般通過調節半抗原與載體的摩爾比、反應環境PH值、溫度、離子強度等來控制偶聯比。所述載體蛋白與所述孔雀石綠半抗原的偶聯比為1 6 1 8，適于抗原的包被和孔雀石綠半抗原空間位點的延展，所述載體蛋白與所述孔雀石綠半抗原的偶聯比具體為 1:8;所述與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述孔雀石綠抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U. 15mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調pH至4. 7)混勻，反應，得到活化后磁性粒子；2)將每2. 5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg孔雀石綠抗體和0. 8ml濃度為50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應，得到含有偶聯后磁性粒子的反應液；3)向步驟2)得到的反應液中加入BSA混勻得到混合液、反應，得到含有封閉后磁性粒子的反應液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質量百分含量)，所述孔雀石綠抗原按照如下方法制備A)將每60ml無水乙醇、24g無水SiCl2、5mg固體強酸離子交換樹脂(阿拉丁公司， 1098585)、0.9g 4-對羧基苯甲醛、2.細11 N，N-二甲苯胺混勻，反應，得到反應液a ；B)冷卻步驟A)得到的反應液a，在每62. 4ml冷卻后反應液a中再加入2ml濃度為lmol/L的鹽酸、30ml無水甲醇，混勻至出現結晶，得到羧基化孔雀石綠；C)將每82mg步驟B)得到的羧基化孔雀石綠溶解于8ml N, N- 二甲苯胺，再加入 20. 6mg DCC (N, N- 二環己基碳化二亞胺)混合，再加入8. 6mgNHS (N-羥基丁二酰亞胺)反應，得到活化的孔雀石綠；D)將每IOOmg載體蛋白溶解于8ml濃度為0. lmol/L、pH為8. 5的硼酸鈉溶液，得到載體蛋白硼酸溶液；E)將每82mg步驟C)得到的活化的孔雀石綠加入8ml步驟D)得到的載體蛋白硼酸溶液，反應，得到反應液b。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中步驟1)中，反應溫度為37°C，反應時間為0. 5h ；步驟2)中，反應溫度為25°C，反應時間為3. 5h ；步驟3)中，反應溫度為37°C，反應時間為0.證。所述孔雀石綠抗原的制備方法中步驟A)中，所述反應溫度為85°C，所述反應時間為25h ；所述反應在氮氣條件下進行；步驟B)中，所述冷卻的時間為12小時；步驟C)中，所述混合的溫度為25°C，所述混合的時間為15min，所述反應為先在 25°C下反應lh，再在4°C下反應1. 5h ；步驟E)中，所述反應溫度為4°C，所述反應時間為3. ^！。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液。所述孔雀石綠抗原的制備方法中在所述步驟E)后還包括將步驟E)得到的反應液b透析、凍干，得到孔雀石綠抗原的步驟。所述透析液為濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，透析時間為Mh，每Mi更換一次透析液。所述孔雀石綠半抗原為孔雀石綠；所述載體蛋白為BSA;由于孔雀石綠是小分子物質，其分子表面特性不利于與反應區即NC膜的直接結合，需要將其與載體蛋白進行偶聯后才能借助于載體蛋白的表面特性而達成與本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬嵐，袁航，吳峰，
申請(專利權)人：清華大學深圳研究生院，
類型：發明
國別省市：94