用于生產(chǎn)高純度神經(jīng)毒素的手段和方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及特異性結(jié)合未加工的和／或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體，或者特異性結(jié)合由具有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１－１６任一項(xiàng)所示氨基酸序列的肽組成的表位的抗體，并涉及生產(chǎn)此類抗體的方法。此外，本發(fā)明專利技術(shù)涉及包含加工的神經(jīng)毒素多肽的組合物，所述組合物不含未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽，以及基于本發(fā)明專利技術(shù)的抗體，生產(chǎn)所述神經(jīng)毒素多肽的方法。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及前述抗體用于分離加工的神經(jīng)毒素多肽與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽，或者用于測(cè)定未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的用途。本發(fā)明專利技術(shù)涉及生產(chǎn)藥物的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】本專利技術(shù)涉及特異性結(jié)合未加工的和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體，或者特異性結(jié)合由具有如SEQ ID NO :1-16的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的肽組成的表位的抗體。此外，本專利技術(shù)涉及用于生產(chǎn)神經(jīng)毒素多肽的方法，包括以下步驟將含有蛋白水解加工的、部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素多肽的混合物的溶液與特異性結(jié)合未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽、但不結(jié)合加工的神經(jīng)毒素多肽的試劑在允許所述試劑與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽結(jié)合的條件下接觸，從而形成抗原-試劑復(fù)合物，并去除所形成的抗原-試劑復(fù)合物，從而獲得含有加工的神經(jīng)毒素多肽而不含未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的溶液。本專利技術(shù)還涉及上述抗體用于分離蛋白水解加工的神經(jīng)毒素多肽與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的用途。本專利技術(shù)涉及用于生產(chǎn)藥物的方法，包括上述方法的步驟，以及將蛋白水解加工的神經(jīng)毒素多肽配制成藥物的其他步驟。此外，本專利技術(shù)涉及包含可通過(guò)上述方法可獲得的蛋白水解加工的神經(jīng)毒素多肽的組合物。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)分別產(chǎn)生高效價(jià)的神經(jīng)毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破傷風(fēng)毒素(TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒素 (CNT)特異性結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞，破壞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素都作為無(wú)活性的未加工的約 150kDa的單鏈蛋白質(zhì)合成。翻譯后加工涉及二硫鍵的形成和細(xì)菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(產(chǎn)生切口)。活性的雙鏈神經(jīng)毒素由兩條鏈組成，由二硫鍵連接的約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的重鏈。CNT結(jié)構(gòu)上包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，S卩，催化輕鏈、包含易位結(jié)構(gòu)域(N端一半)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C端一半)的重鏈，參見(jiàn)Krieglstein 1990，Eur J Biochem 188， 39 ；Krieglstein 1991, Eur T Biochem202,41；Krieglstein 1994， J Protein Chem 13， 49。肉毒梭菌分泌7種抗原性不同的血清型，命名為肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)A至G。 所有的血清型與由破傷風(fēng)梭菌分泌的相關(guān)的破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)，都是Si2+-內(nèi)切蛋白酶，通過(guò)切割SNARE蛋白來(lái)阻斷突觸的胞吐。CNT導(dǎo)致在肉毒中毒和破傷風(fēng)中可見(jiàn)的弛緩性肌肉麻痹，見(jiàn) Fischer 2007，PNAS 104,10447。不論其毒性效應(yīng)，肉毒桿菌毒素復(fù)合物已用作多種疾病的治療劑。肉毒桿菌毒素A型血清型已于1989年被美國(guó)批準(zhǔn)用于人類用途，治療斜視、眼瞼痙攣和其他病癥。其可作為肉毒桿菌毒素A蛋白制劑商購(gòu)，例如商標(biāo)名BOTOX(Allergan Inc)、商標(biāo)名 DYSP0RT(Ipsen Ltd)。對(duì)于治療應(yīng)用，復(fù)合物被直接注射到待治療的肌肉中。在生理pH下， 毒素從蛋白質(zhì)復(fù)合物中釋放，產(chǎn)生所希望的藥理學(xué)作用。不含復(fù)合蛋白質(zhì)的改良的BoNT/A 制劑可以商標(biāo)名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)獲得。肉毒桿菌毒素的效應(yīng)只是暫時(shí)的，這是維持治療效果需要重復(fù)施用肉毒桿菌毒素的原因。梭菌神經(jīng)毒素減弱隨意肌肌力，是斜視、灶性張力障礙包括頸肌張力障礙和良性自發(fā)性瞼痙攣的有效療法。其還進(jìn)一步表現(xiàn)出緩解偏側(cè)面肌痙攣和局部痙攣，并且對(duì)廣泛的其他適應(yīng)癥有效，例如胃腸道功能障礙、多汗和美容紋校正，見(jiàn)Jost 2007, Drugs 67， 669。為了生產(chǎn)梭菌神經(jīng)毒素，對(duì)含神經(jīng)毒素的發(fā)酵溶液的純化是特別重要的。在本上下文中，通常在不同的沉淀和提取步驟后使用濃縮步驟和其他不同的層析步驟，從而獲得純化的神經(jīng)毒素，見(jiàn) DasGupta 1984, Toxicon 22,415 ；Sathyamoorthy 1985， J Biol Chemistry 260,10461.目前，可獲得的神經(jīng)毒素制劑除理想的活性(加工的)神經(jīng)毒素外， 還包括蛋白水解未加工的前體和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽。蛋白水解未加工的前體或部分加工的多肽僅在少數(shù)氨基酸的序列上不同于活性(加工的)神經(jīng)毒素多肽。因此，基于其化學(xué)和物理性質(zhì)它們是難以區(qū)分的。另一方面，蛋白水解未加工的前體和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽占總蛋白質(zhì)的比例在此類制劑中仍然是顯著的。所述比例是由于生物學(xué)系統(tǒng)，并且是由生物合成和發(fā)酵過(guò)程的條件決定的。因而，神經(jīng)毒素制劑中不需要的蛋白水解未加工的前體和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的量是預(yù)先確定的，且目前是難以降低的。用于降低未加工的和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽，以及從而改善神經(jīng)毒素制劑的質(zhì)量的的手段和方法是非常必需但仍不可得的。因而，本專利技術(shù)潛在的技術(shù)問(wèn)題可視為通過(guò)滿足上述需要，提供改善神經(jīng)毒素多肽生產(chǎn)的手段和方法。所述技術(shù)問(wèn)題是由權(quán)利要求和下文表征的實(shí)施方案解決的。本專利技術(shù)涉及特異性結(jié)合由具有如SEQ ID NO :1_16的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的肽組成的表位的抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋了單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、人的、人源化的、靈長(zhǎng)類化的或嵌合的抗體、雙特異性抗體、合成抗體、化學(xué)或酶促修飾的衍生物、任意所述抗體的片段或由天然存在的和/或化學(xué)修飾的核酸組成的適體。所述抗體的片段包括 F(ab' )2、F(ab)、Fv或scFv片段，或任意這類片段的化學(xué)或酶促修飾的衍生物。本專利技術(shù)的抗體應(yīng)該特異性結(jié)合由上述肽組成的表位，如果所述肽包含在部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素多肽之內(nèi)。根據(jù)本專利技術(shù)的術(shù)語(yǔ)“表位”涉及被本專利技術(shù)的抗體識(shí)別的抗原決定簇。其由具有如 SEQ ID NO :1-16的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的肽組成。在本專利技術(shù)的一個(gè)方面，前述表位代表了這樣的肽，所述肽的側(cè)翼是神經(jīng)毒素加工酶的切割位點(diǎn)或覆蓋了所述切割位點(diǎn)，見(jiàn)下表1 和2。在本專利技術(shù)的一個(gè)方面，表位包含在蛋白水解未加工的神經(jīng)毒素多肽或在部分加工的神經(jīng)毒素多肽中。部分加工的神經(jīng)毒素多肽可以是用SEQ ID NO :1-8的任一項(xiàng)所示肽序列延伸的神經(jīng)毒素多肽的輕鏈，或者是用SEQ ID NO :1-8的任一項(xiàng)所示肽序列延伸的神經(jīng)毒素多肽的重鏈。由于存在所述表位，未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽可以被抗體特異性的結(jié)合。表1 神經(jīng)毒素血清型的表位和全長(zhǎng)多肽的氨基酸序列權(quán)利要求1.特異性結(jié)合由具有SEQID NO :1至16所示氨基酸序列的肽組成的表位的抗體。2.權(quán)利要求1的抗體，其是單克隆或多克隆抗體。3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述表位包含在蛋白水解未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽中。4.權(quán)利要求3的抗體，其中所述神經(jīng)毒素多肽來(lái)自梭菌屬。5.生產(chǎn)特異性結(jié)合未加工的和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體的方法，包括步驟a)將來(lái)自用包含SEQID NO :25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫過(guò)的非人動(dòng)物的多克隆抗血清與具有SEQ ID NO :25的肽在允許形成包含前述肽和特異性結(jié)合未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體的復(fù)合物的條件下接觸；b)從抗血清中去除步驟a)中形成的復(fù)合物；和c)從所述復(fù)合物中釋放與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽特異性結(jié)合的抗體。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述方法在步驟a)之前進(jìn)一步包括步驟i)將所述來(lái)自用包含SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫過(guò)的非人動(dòng)物的多克隆抗血清與下列捕獲肽SL本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．特異性結(jié)合由具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至１６所示氨基酸序列的肽組成的表位的抗體。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：M·普法伊爾，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：莫茨制藥有限及兩合公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：DE