提純核酸的方法，特別是從固定組織中提純核酸的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種核酸提純方法、一種用于實施本發(fā)明專利技術(shù)方法的試劑盒以及磁性粒子在生物樣本提純方面的一種新應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)的方法包括以下步驟：ａ）將所述樣本送入一種水溶液；ｂ）裂解所述樣本；ｃ）去除細(xì)胞碎片；以及ｄ）從所述溶液中分離出所述核酸，其中，步驟ａ）至ｃ）在無離液條件下進(jìn)行。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】提純核酸的方法，特別是從固定組織中提純核酸的方法
本專利技術(shù)涉及一種核酸提純方法、一種用于實施本專利技術(shù)方法的試劑盒以及磁性粒子在生物樣本提純方面的一種新應(yīng)用。
技術(shù)介紹
近年來，分子診斷學(xué)越來越重要。分子診斷學(xué)已進(jìn)入疾病的臨床診斷(例如檢測傳染病病原體、檢測基因組突變、發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及識別疾病易感體質(zhì)的危險因素)。分子診斷學(xué)的方法目前也應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析和食品檢測等領(lǐng)域。此外還應(yīng)用于病理學(xué)/細(xì)胞學(xué)研究所中的檢查或法醫(yī)課題。現(xiàn)今在健康檢查中(例如檢查庫存血中是否存在傳染病病原體)也采用基因診斷，而且立法部門計劃在未來以立法的形式對這類檢測予以相應(yīng)規(guī)定。諸如雜交或擴(kuò)增技術(shù)(例如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)、LCR(連接酶鏈反應(yīng))、bDNA(分支DNA)或NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù))等同時應(yīng)用于臨床分子診斷的方法也屬于學(xué)術(shù)性基本操作的常規(guī)方法。核酸分析主要通過測定組織中的基因表達(dá)為腫瘤疾病的研究和診斷開辟了大有前途的新途徑。舉例而言，所謂的微陣列系統(tǒng)通過一種單一方法就可以確定成千上萬種基因的表達(dá)。其中，將樣本材料(即已提純的核酸，例如RNA或cDNA)置于一個具有相應(yīng)低(聚)核苷酸探針的芯片上，以便通過雜交來檢測樣本中的核酸。此外還存在其他用于檢測樣本中的核酸的常見方法，例如擴(kuò)增法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。核酸分析的主要問題在于樣本制備。待檢樣本中的細(xì)胞或組織往往含有部分不溶性干擾成分(即所謂的碎片)，這些成分可能妨礙接下來的分離和分析工作。這類不溶性成分主要出現(xiàn)在糞便、血液、疣、鈣化結(jié)構(gòu)(骨骼)或嚴(yán)重壞死的組織樣本的核酸分離過程中。但是，廣義上的碎片也包括可溶性成分，例如從紅細(xì)胞中釋放出來的、需要在核酸分離過程中加以分離的超量血紅蛋白。這一問題在腫瘤診斷中影響特別嚴(yán)重，因為這個領(lǐng)域通常采用福爾馬林固定的石蠟包埋切片(FFPE切片)作為樣本材料。在患者身上采樣時，例如進(jìn)行活組織切片檢查或?qū)δ[瘤物質(zhì)(Tumormaterial)進(jìn)行手術(shù)采樣時，用福爾馬林固定組織材料并將其包埋在石蠟中以加固樣本材料。該固定物質(zhì)可在培養(yǎng)過程中乃至數(shù)年之后在組織塊內(nèi)部形成生物分子的大量交聯(lián)(核酸與蛋白之間以及蛋白之間或核酸之間的交聯(lián))。這些處于細(xì)胞內(nèi)部和外部的交聯(lián)結(jié)構(gòu)促成了不溶性碎片或者說很難裂解或不可裂解的碎片的產(chǎn)生。石蠟包埋樣本通常被制成切片以供病理學(xué)家鑒定，這些切片也可用作核酸分析的起始材料。進(jìn)行核酸提純時，必須在裂解后去除細(xì)胞碎片和石蠟。此外，從糞便樣本中提純核酸的過程也會出現(xiàn)上述部分不溶性干擾成分(碎片)這一問題。一方面，糞便樣本由食物中的難消化成分(粗纖維)以及未被上部大腸吸收的未消化殘余物如脂肪、淀粉、結(jié)締組織纖維、肌纖維和水構(gòu)成。還有人體自身產(chǎn)生的物質(zhì)：排出的腸細(xì)胞、殘余的消化酶及粘液。另一方面，少量的膽汁酸、同樣從膽囊中排出的對腸粘膜起保護(hù)作用的卵磷脂及其他磷脂也連同糞便一起排出體外。為了降低成本并盡量縮短從采樣到測定分析結(jié)果的處理時間，當(dāng)務(wù)之急是盡量提高核酸提純方法的效率和自動化程度。特別是診斷領(lǐng)域。適合自動化的是那些只需用少數(shù)幾種反應(yīng)容器及標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)格(如96孔板規(guī)格)就可實施的方法，因為這類方法可以采用高效率的自動吸液(Pipetierroboter)裝置。因此，現(xiàn)有技術(shù)需要一種簡單、高效又能最大程度自動化的樣本制備方法。常見的核酸提純方法包括在離液條件下的樣本裂解、萃取式提純以及從液相中進(jìn)行沉淀及提純等步驟，例如苯酚-氯仿提取(參閱Sambrook等人的“Molecularcloning-alaboratorymanual(分子克隆實驗手冊)”第3版，冷泉港實驗室，冷泉港出版社出版，2001年，ISBN-13：978-0879695774)，或者例如在WO2003040364-A1中公開的所謂的柱提純法(Aufreinigungsverfahren)。Chomcznski在US5,346,994中描述了一種常見的核酸分離方法，其中，使用苯酚和離液化合物(chaotropenVerbindung)異硫氰酸胍來從液相中分離核酸，在此基礎(chǔ)上從組織材料中提純核酸。為此須在水溶液中將樣本均質(zhì)化并在添加異硫氰酸胍(GTC)和苯酚/氯仿后進(jìn)行離心處理。蛋白位于有機(jī)相中，DNA位于中間相中，RNA位于水相中。RNA可從水相中沉淀出來。但是，這個方法無法可靠地從FFPE組織樣本中提純RNA。其他用于分離DNA或RNA的已知方法通常采用離液鹽或苯酚提取。EP0819696揭示一種核酸提純方法，這種方法的原理是在離液條件下將核酸結(jié)合在二氧化硅或其他二氧化硅衍生物上。其中，使樣本在離液裂解緩沖液中裂解并將核酸結(jié)合在二氧化硅基質(zhì)上。從石蠟切片中提純核酸的現(xiàn)有已知方法首先需要實施一個復(fù)雜的去石蠟步驟，通常是用二甲苯去除石蠟，而后需要用二甲苯/乙醇稀釋系列進(jìn)行復(fù)雜的再水化處理。有鑒于此，WO200146402A1描述了一種從固定的石蠟切片中提純核酸的方法，其中，先將石蠟切片放入一個艾本德(Eppendorf)反應(yīng)容器并用二甲苯進(jìn)行去石蠟處理。隨后需要通過二甲苯/乙醇稀釋系列來對該切片進(jìn)行再水化處理。接下來將樣本放在離液溶液中加熱一段較長的時間(5至120分鐘)，以便提純RNA。這種方法雖然能夠有效地去除石蠟，但其復(fù)雜程度高而且由于需實施多個離心步驟而難以實現(xiàn)自動化。
技術(shù)實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的是提供一種相對于現(xiàn)有技術(shù)而言有所改進(jìn)的核酸提純方法，特別是適合自動化的方法。定義：“生物樣本”這一概念指的是任何一種含有細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的樣本，特別是細(xì)胞、冷凍細(xì)胞團(tuán)塊、固定細(xì)胞、糞便、“白細(xì)胞層”(即血沉棕黃層)、腹水、涂片(特別是腮部或咽喉涂片，尤其是宮頸涂片)、唾液、器官抽出物(Organpunktat)、精液、組織樣本、固定組織樣本、固定或非固定組織樣本的組織切片(特別是冷凍切片和石蠟切片，尤其是福爾馬林固定的石蠟切片)、腫瘤物質(zhì)、活檢樣本、血樣(特別是全血或血塊)、細(xì)胞懸液，廣義上“生物樣本”是指所有含有細(xì)胞成分的樣本，這里的細(xì)胞成分既指完整細(xì)胞也指細(xì)胞組成部分。此外，“生物樣本”這個概念也包括其他含核酸的生物材料，例如血清或血漿(特別是帶病毒的血清或血漿，尤其是感染HIV和HCV的血清樣本)、分泌物、腦脊液、膽汁、淋巴液、尿液。也可以是產(chǎn)生于生化或生物技術(shù)處理過程且需加以提純的含核酸材料。“細(xì)胞”這個概念既指原核細(xì)胞也指真核細(xì)胞。“樣本裂解”指的是樣本中細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破裂。這個概念主要包括機(jī)械裂解(例如利用超聲波)、熱解(例如通過冷凍-解凍循環(huán)，加熱樣本)和化學(xué)裂解(例如利用去垢劑)。然而，“樣本裂解”這一概念的適用范圍不僅限于細(xì)胞，也可以指利用上述方法從非細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)或復(fù)合物中釋放出核酸。“核酸”這個概念包括寡聚及聚合的核糖核苷酸或者鏈長超過10個單體單元的2′-脫氧核糖核苷酸。核酸中的這些單體單元通過位于相鄰單體單元的3′羥基和5′羥基之間的磷酸二酯鍵相連，且一種雜環(huán)堿基糖苷結(jié)合在相應(yīng)碳水化合物組分的1′原子上。核酸可以通過形成分子間氫鍵來形成雙鏈及三鏈核酸。“核酸”這一概念還包括蛋白-核酸絡(luò)合物以及含合成核苷酸的核酸，例如嗎啉代、LNA或PNA。“離液條件”這個概念指存在離液本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
１．一種從一種生物樣本中提純核酸的方法，包括下列步驟：ａ）將所述樣本送入一種水溶液；ｂ）裂解所述樣本；ｃ）通過懸浮在所述溶液中的磁性粒子來去除細(xì)胞碎片，用磁場保持這些磁性粒子并從所述溶液中去除這些磁性粒子；以及ｄ）從所述溶液中分離出所述核酸；其中，步驟（ａ）至（ｃ）在無離液條件下進(jìn)行。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】DE10200802935632008年6月20日1.一種從一種生物樣本中提純核酸的方法，包括下列步驟：a)將所述樣本送入一種水溶液；b)裂解所述樣本；c)通過懸浮在所述溶液中的磁性粒子來去除細(xì)胞碎片，用磁場保持這些磁性粒子并從所述溶液中去除這些磁性粒子，其中所述細(xì)胞碎片包括蛋白和細(xì)胞膜成分；以及d)從所述溶液中分離出所述核酸；其中，步驟(a)至(c)在無離液條件下進(jìn)行；在實施步驟(d)之前將所述溶液加熱到至少50℃。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述磁性粒子的平均粒度<50μm。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述磁性粒子具有一種含硅涂層。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述磁性粒子具有一種含二氧化硅的涂層。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣本是一種血樣。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物樣本是一種石蠟包埋樣本和/或一種固定樣本。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在實施步驟(d)之前將所述溶液加熱到至少60℃。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在實施步驟(d)之前將所述溶液加熱到60℃-95℃。...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：海克·奧伊延，
申請(專利權(quán))人：西門子醫(yī)學(xué)診斷有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：DE