免疫學測定方法和測定用試劑盒技術

本發明專利技術的測定樣本中的被測定物的方法，該方法包括：（ａ）將包含該被測定物的樣本、具有復數個與該被測定物特異地結合的物質的復合體、和在不溶性載體上結合有該被測定物或該被測定物的類似物的微小粒子混合的工序；以及（ｂ）在由該工序（ａ）得到的該混合液中，測定該微小粒子的凝集反應的工序。根據本發明專利技術的方法，例如，通過不是以單體形式使用抗體，而是以復數個抗體的復合體形式使用，從而測定靈敏度提高，因而可進行低濃度區域內的測定。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用結合有物質的微小粒子的免疫學測定方法。尤其涉及主要在工業、環境和臨床檢查領域中的、利用了抗原抗體反應的微量成分的免疫學測定方法以及免疫學測定用試劑盒。
技術介紹
近年來，在臨床檢查等各種檢查中，正謀求自動化和測定時間的縮短。作為這樣的檢查方法，利用免疫反應的測定方法正在被廣泛使用來用于測定生物試料中的物質。作為免疫學測定方法，有放射免疫測定(RIA)法、酶免疫測定(EIA)法、比濁免疫測定法、乳膠凝集法、膠體金凝集法、免疫色譜法等多種方法。其中，乳膠凝集法或膠體金凝集法由于可在無需反應液的分離、洗滌操作的均相體系中測定，所以適于測定的自動化和在短時間內的測定。尤其是膠體金粒子為5nm IOOnm的大小，其小于乳膠粒子，因而可用于更微量物質的測定(專利文獻1和2)。這些測定方法中的主反應成分是結合了與被測定物特異地反應(例如結合)的物質的乳膠粒子或膠體金粒子等微小粒子。當與結合在微小粒子上的被測定物特異地反應的物質具有復數個與被測定物特異地反應的部位時，通過使與結合在微小粒子上的被測定物特異地反應的物質與被測定物反應，從而使微小粒子發生凝集，由該凝集程度算出被測定物的濃度。但是，當與結合在微小粒子上的被測定物特異地反應的物質與被測定物特異地反應的部位只有一處時，即使該物質與被測定物反應，也只是在其一處發生反應(例如結合)，因而不發生微小粒子的凝集。因此，利用競爭法來測定被測定物，所述競爭法即通過使具有復數個與被測定物反應的部位的競爭體(competitor)在測定體系中共存，而使微粒發生凝集，測定依賴于被測定物濃度的凝集程度?；蛘?，示出如下方法在通過使乳膠粒子或膠體金粒子等微小粒子(該微小粒子結合有復數個被測定物或被測定物的類似物)和物質(該物質是與被測定物特異地結合的物質)反應而發生凝集的反應體系中，通過共存被測定物，從而抑制其凝集反應，通過測定該抑制的程度來測定被測定物的方法(非專利文獻1)。在該方法中，當以單體形式使用抗體作為與被測定物特異地結合的物質時，由于被測定物、或者結合有復數個半抗原的乳膠粒子或膠體金粒子與抗體的結合而發生的凝集不充分，有時得不到實用的測定靈敏度?，F有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2005-283250號公報專利文獻2 日本特開2004-325192號公報非專利文獻非專利文獻1 山田滿廣，醫療和檢查機器及試劑(醫療i検查機器 試薬)，19 卷，4 號，523-528 頁，1996 年
技術實現思路
專利技術要解決的課題本專利技術的目的在于提供一種測定方法和測定用試劑盒，所述方法為利用使用微小粒子的以往的反應體系的測定方法，即，在通過使乳膠粒子或膠體金粒子(該乳膠粒子或膠體金粒子結合有復數個被測定物或被測定物的類似物)與物質(該物質是與被測定物特異地結合的物質)反應來發生凝集的反應體系中，通過共存被測定物來抑制其凝集反應， 并測定該抑制的程度的被測定物的測定方法，其中，使其測定靈敏度提高，而且可在更寬的濃度區域內測定被測定物。解決課題的手段本專利技術發現在上述測定方法中，不以單體形式使用與被測定物特異地結合的物質、而是使用結合有復數個該特異地結合的物質的復合體，從而顯著促進與結合有復數個被測定物或被測定物的類似物的微小粒子的凝集反應，被測定物的測定靈敏度顯著上升， 從而完成了本專利技術。即，本專利技術是基于如下現象的測定方法使上述復合體、結合有復數個被測定物或被測定物的類似物的微小粒子、和樣本中的被測定物在反應液中共存來使凝集反應發生，以依賴于源自樣本的被測定物的濃度的方式抑制凝集反應。本專利技術提供測定樣本中的被測定物的方法，該方法包括(a)將含有該被測定物的樣本、具有復數個與該被測定物特異地結合的物質的復合體、和在不溶性載體上結合有該被測定物或該被測定物的類似物的微小粒子混合的工序；和(b)在由該工序(a)得到的該混合液中，測定該微小粒子的凝集反應的工序。本專利技術還提供測定用試劑盒，該試劑盒包括第一試劑，其包含具有復數個與被測定物特異地結合的物質的復合體；和第二試劑，其包含在不溶性載體上結合有該被測定物或該被測定物的類似物的微小粒子。在一個實施方式中，上述復合體是結合有復數個抗上述被測定物的抗體的物質。在另一實施方式中，上述被測定物是半抗原，而且上述被測定物的類似物是半抗原結合蛋白。在又一實施方式中，上述被測定物的類似物是可識別并且結合與上述被測定物特異地結合的物質的物質，其為(i)具有該被測定物的位點的物質、(ii)具有該位點的物質的結構類似物、或(iii)結合有復數個具有該位點的物質或該結構類似物的物質。在再一實施方式中，上述不溶性載體為乳膠或膠體金。專利技術效果根據本專利技術，不以單體形式使用與被測定物特異地結合的物質，而是使用結合有復數個該物質的復合體，因而顯著促進與結合有復數個被測定物或被測定物的類似物的微小粒子(乳膠粒子、膠體金粒子等)的凝集反應，被測定物的測定靈敏度顯著上升。因此，現有技術無法測定的在低濃度區域內的測定成為可能，可在更寬濃度區域內測定被測定物。此外，在以往的方法中，當凝集反應沒有進展時向反應液中添加凝集促進劑(例如聚乙二醇、硫酸軟骨素)，因而有這樣的問題反應液的粘度增加而難于處理，并且影響重現性。與此相對，在本專利技術的方法中，即使不添加凝集促進劑，凝集也充分進行，因而處理及重現性良好。附圖說明圖1為表示在二乙酰精胺測定1中，使用第一試劑(a)、(b)和(C)時的二乙酰精胺濃度與吸光度變化量的關系的圖(實施例7)。圖2為表示在二乙酰精胺測定2中，使用第一試劑(d)和(e)時的二乙酰精胺濃度與吸光度變化量的關系的圖(實施例10)。具體實施例方式(樣本)在本專利技術中，作為包含供測定的被測定物的樣本，可列舉血液、血漿、血清、尿、糞便(懸濁液)、腦脊液、腹水等生物試料；從環境中得到的樣品或其提取物等。(被測定物)被測定物只要是與該被測定物特異地結合的物質可以存在、或者可制造這樣的物質，則沒有特別限制。作為被測定物，可列舉例如白蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白Ale、肌紅蛋白、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、鐵蛋白、α -胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9、 前列腺特異抗原、C反應蛋白(CRP)、纖維素降解產物(FDP)、胃蛋白酶原I和II、膠原等蛋白質；高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等脂質蛋白；脫氧核糖核酸、核糖核酸等核酸；堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、脂肪酶、淀粉酶等酶；IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、幽門螺桿菌、抗它們的抗體等與傳染病相關的抗原和抗體；精胺、亞精胺、腐胺、二乙酰精胺等多胺、以及生理活性物質；氟哌啶醇、溴哌利多等藥物；性激素等激素等。(與被測定物特異地結合的物質的復合體)作為與被測定物特異地結合的物質(下面有時稱為“特異結合物質”)，可列舉可在利用免疫反應的免疫學測定方法中使用的抗體或抗原。例如，可列舉抗體或抗原、受體、 凝集素、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等具有結合親和性的物質。從可特異地識別被測定物且易于識別下面詳述的與不溶性載體結合的被測定物或其類似物這點考慮，優選多克隆抗體或單克隆抗體。特異結合物質的復合體(下面有時簡稱為“復合體”)只要是具有復數個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．測定樣本中的被測定物的方法，該方法包括：（ａ）將包含該被測定物的樣本、具有復數個與該被測定物特異地結合的物質的復合體、和在不溶性載體上結合有該被測定物或該被測定物的類似物的微小粒子混合的工序；以及（ｂ）在由該工序（ａ）得到的該混合液中，測定該微小粒子的凝集反應的工序。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：田中睦，
申請(專利權)人：愛芙樂賽制藥株式會社，
類型：發明
國別省市：JP