用于預測對天冬酰胺酶活性的中和作用的測試制造技術

一種體外測量獲取自患者的可能含有天冬酰胺酶中和因子的血液、血漿、血清或衍生基質樣品中能中和天冬酰胺酶活性之因子的存在的方法，其包括將所述樣品與天冬酰胺酶混合，孵育所述混合物，然后測量混合物中剩余的天冬酰胺酶活性并確定所述中和因子的存在或對其定量。用于預測天冬酰胺酶治療效果的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于預測對天冬酰胺酶活性的中和作用的測試本專利技術涉及診斷患者對用治療性酶天冬酰胺酶治療的反應能力的測試。本專利技術尤其涉及預測在給定患者中使用天冬酰胺酶的治療效果的測試。L-天冬酰胺酶是已應用超過30年的治療急性淋巴母細胞性白血病的化學治療方案的基本組分。其作用機制基于血漿氨基酸天冬酰胺的水解，天冬酰胺是淋巴母細胞腫瘤樣生長的必要要素。不同于正常細胞，癌性淋巴母細胞自身不能產生其天冬酰胺，而是依賴細胞外來源。用天冬酰胺酶處理使其喪失該必要成分，從而使它們死亡。目前市售的產自微生物的所述酶有三種形式：前兩種來自細菌來源大腸桿菌(Escherichiacoli)和菊歐文氏菌(Erwiniachrysanthemi)，第三種來自聚乙二醇與天然大腸桿菌天冬酰胺酶的共價鍵偶聯(PEG-天冬酰胺酶)。盡管其具有相當的抗白血病效果，但用天冬酰胺酶進行的治療與一定數量的并發癥相關，所述并發癥與該酶的免疫原性有關。這些并發癥可反映為臨床表現或沉默失活。許多作者已報道了超敏反應，其嚴重性從中度過敏反應到過敏性休克(Wang等，JournalofImmunologicalMethods，239(200)75-83)。使用三種形式天冬酰胺酶所觀察到的該類反應的發生通常引起由于害怕更嚴重反應而導致治療停止。此外，天冬酰胺酶導致具有中和特性的循環抗體的出現，這反映為網狀內皮系統對該酶清除的增加和其治療效果的降低(MüllerH.J.，BoosJ.CritRevOncol/hematol1998；(28)：97-113)。用三種形式的酶(大腸桿菌、歐文氏菌(Erwinia)和PEG-天冬酰胺酶)均發現這些抗體，在這種情況下，用天冬酰胺酶達到在延長時間段內快速且完全地耗盡血漿天冬酰胺的治療目標未實現。這種患者血清中存在的中和因子(主要是抗體)導致的該酶失活不伴隨臨床征兆，對臨床醫師而言其是沉默的。因此本專利技術人認為，臨床醫師很需要一種快速易用的測試為他們使用，以用于預測患者血清中天冬酰胺酶中和因子(主要是抗體)的存在。該測試將使得可以調整酶的施用劑量，或用另一種形式的對這些中和因子不敏感或敏感性更低的天冬酰胺酶替代所用的天冬酰胺酶。對于監測患者天冬酰胺酶活性，考慮了幾種可能性：●血漿L-天冬酰胺的測定●血漿L-天冬酰胺酶活性的測定●抗天冬酰胺酶抗體的測定血漿天冬酰胺水平是反映天冬酰胺酶所期望達到的治療作用(快速、完全和持久地去除天冬酰胺)的主要生物化學參數。因此對該測定已描述了幾種方法。它們大部分是基于將通過高效液相色譜分離待測定樣品的組分的階段和熒光檢測或通過質譜定量整合在一起。這些方法很繁瑣，需要專業人員，并且其費用和花費的時間不適于常規臨床應用。最近，Verma等描述了一種快速測定天冬酰胺的方法，其基于L-天冬酰胺酶和有色指示劑在多種基質(硝酸纖維素膜、硅凝膠或藻酸鈣珠)上的共固定。當將這些支持物之一與患者血清樣品接觸時，固定化的L-天冬酰胺酶會降解存在的天冬酰胺。該水解反應后產生的銨能使酚紅指示劑變色。盡管該方法似乎滿足了應用簡單及迅速的要求，作者沒有提供可證實它的數據，對其準確性仍存有疑問。除了缺乏可簡單快速使用的經驗證的方法之外，血漿L-天冬酰胺的測定受以下因素的限制。在體內，通過天冬酰胺酶作用實現的天冬酰胺降解被天冬酰胺的生理產生所平衡，而在體外，所述酶對天冬酰胺的催化作用將持續。作為直接結果，當血清樣品來自于經天冬酰胺酶治療的患者時，剩余量的酶的存在會導致天冬酰胺水平檢測的偏差，其會“虛假地”低于生理水平(Boos等，Europeanjournalofcancer(1996)32，1544-1550)。對分析過程的這種干擾導致結果與所檢測患者中天冬酰胺酶的生理活性之間缺乏相關性。已描述了幾種測定血漿L-天冬酰胺酶的方法，最常用的方法基于：將含有L-天冬酰胺酶的血清在含有L-天冬酰胺的緩沖液中孵育，而后在終止反應后，用Nessler試劑測定產生的銨。Orsonneau等提出了一個更快更準確的自動化的變化方案以監測用L-天冬酰胺酶治療的患者(J.L.Orsonneau等，AnnBiolClin2004，62：568-72)。該方法基于谷氨酸脫氫酶的作用，其利用L-天冬酰胺酶水解L-天冬酰胺時產生的銨將α-酮戊二酸轉變成谷氨酸。谷氨酸脫氫酶α-酮戊二酸+NH4++NADPH→L-谷氨酸+NADP+H2O在該反應中，反應過程中被氧化的NADPH的量相當于樣品中所含的氨的量，并可通過檢測光密度的降低來測定。由此可監測銨生成的動力學并計算L-天冬酰胺酶的活性。盡管該方法使監測患者的L-天冬酰胺酶活性成為可能，它也沒提供關于存在于血清中的因子對該酶的中和作用的任何預測信息。Wang等開發了用于定量患者血漿樣品中抗天冬酰胺酶IgG的標準化ELISA測試(B.Wang等，JournalofImmunologicalMethods239(2000)75-83)。該測試用于在臨床研究范圍內測量患者血清中存在的抗天冬酰胺酶抗體的濃度，所述患者患急性淋巴母細胞性白血病，并用L-天冬酰胺酶治療并且出現或未出現過敏反應(M.H.Woo等，Leukemia(1998)12，1527-1533)。該作者證明，不管是在過敏反應出現前或后進行檢測，抗天冬酰胺酶抗體濃度的中值在出現過敏反應的患者中都更高。他們得出結論，在臨床實踐中采用該檢測利于預測過敏反應的未來發生。然而，該檢測的預測價值是值得懷疑的；出現過敏反應前所測的抗天冬酰胺酶抗體濃度的變化范圍有交疊，它們分別為：●對于隨后出現過敏反應的患者，OD為0.001-0.375單位；●對于隨后未出現過敏反應的患者，OD為0.004-0.064單位。此外，抗體濃度的測量沒有提供關于患者中天冬酰胺酶的藥理活性和血清中所存在因子的可能中和作用的任何信息。E.H.Panosyan等，J.Pediatr.Hematol.Oncol.2004，26，4：217-226調查了患者血清中的抗天冬酰胺酶抗體和天冬酰胺酶的酶活性。該作者描述了采用患者血清樣品作為抗天冬酰胺酶抗體來源而進行的離體中和測定。將血清樣品與天然或PEG-天冬酰胺酶的抗原溶液一起孵育，并測量剩余的天冬酰胺酶的酶活性。該作者最終推薦在臨床環境下對血清抗天冬酰胺酶抗體進行標準監測。因此，本專利技術的目的是提出能克服現有技術缺點并能在給定時刻了解患者是否具有可中和天冬酰胺酶活性的因子的新方法。所述方法必須有具有完全預測性的優點，即它必須不需要向待診斷患者施用所述酶的階段。其必須反映患者對任何形式的天冬酰胺酶的反應能力。因此，所述患者可為第一次用該酶治療的患者，或已用天冬酰胺酶治療或者目前正用天冬酰胺酶治療的患者。其能檢測可中和之前或目前治療所用酶之活性的因子的存在，這使了解用該酶進行的治療是否可被恢復或繼續和任選地調整成為可能。該方法還能檢測可中和考慮用于所述患者治療中的酶之活性的因子的存在，這使確證或排除特定酶的使用成為可能。該認識將在治療形式(劑量、給藥方案)或者酶或其施用形式的選擇方面為專業人員提供比現有技術的方法恰當得多的指導。所述中和因子或不存在或以足夠低水平存在而能用所檢測酶進行治療(任選地加強劑量或劑量方案)。或者所述中和因子的存在水平對于本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．用于預測天冬酰胺酶是否可在患者中有活性的方法，其中對獲取自所述患者的樣品中中和天冬酰胺酶活性的因子的存在進行體外測量，所述樣品為可能包含所述中和因子的血液、血漿、血清或衍生基質的樣品。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】FR08576042008年11月7日1.對樣品中中和天冬酰胺酶活性的因子的存在進行體外測量的非疾病的診斷和治療的方法，所述樣品為可能包含天冬酰胺酶中和因子的血液、血漿、血清或衍生基質的樣品，其包括以下階段：(a)將所述樣品與已知量的所述天冬酰胺酶一起孵育；(a1)從孵育的樣品中去除任何在孵育步驟(a)中形成的抗體-天冬酰胺酶免疫復合物，并回收不含抗體-天冬酰胺酶免疫復合物的基質；(b)將前述基質與已知量的天冬酰胺一起孵育；(c)將前述混合物與適于測定所述天冬酰胺酶的剩余酶活性的試劑系統一起孵育；(d)定性或定量評價所述樣品中所述天冬酰胺酶酶活性的損失或存留，其與所述樣品中所述天冬酰胺酶中和因子的存在或含量相關。2.權利要求1的方法，其包括以下步驟：(a)將樣品與0.1至5IU/ml的天冬酰胺酶一起孵育1-60分鐘，(a1)去除免疫復合物，通過以3000-25000g在指定速度下離心1-30分鐘，回收上清液；(b)將從(a1)得到的上清液與飽和量的天冬酰胺一起孵育2-60分鐘；(c)將前述混合物與能檢測剩余酶活性的試劑系統一起孵育；(d)定性或者定量評價酶活性的損失或存留，其與所述樣品中天冬酰胺酶中和因子的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：揚·戈德弗蘭，
申請(專利權)人：愛瑞泰克藥物公司，
類型：發明
國別省市：FR