一種二十碳五烯酸生產(chǎn)菌株的篩選方法，本發(fā)明專利技術(shù)是將采集的土樣用誘物塊誘導(dǎo)培養(yǎng)，將分離純化得到的純菌株經(jīng)染色后初步篩選，再經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取油脂，進行氣相色譜分析，篩選得到EPA含量高的菌株。本發(fā)明專利技術(shù)能快速有效地篩選到二十碳五烯酸產(chǎn)量高的真菌菌株，方法步驟簡單、篩選周期短，而且所篩選菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培養(yǎng)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，對擴大二十碳五烯酸的微生物來源及其商業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本發(fā) 明涉及微生物菌種篩選技術(shù)，特別涉及。
技術(shù)介紹
二十碳五烯酸(EPA)是ω -3系列多不飽和脂肪酸的一種，人體能通過植物中攝取的α-亞麻酸微量地轉(zhuǎn)化為ΕΡΑ，滿足一般健康需求。但是老年人、幼兒及糖尿病人則不能將α _亞麻酸有效地轉(zhuǎn)化為ΕΡΑ，這就必需從食物中直接攝取EPA。二十碳五烯酸又俗稱“血管清道夫”，能抑制血小板凝集，減少血栓素形成，具有預(yù)防心肌梗塞和腦梗塞作用，同時具有降血脂、防動脈硬化、抗癌及抗炎的作用。由于EPA對機體具有良好的生理功效，目前已在醫(yī)藥、食品、飼料、化工領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外市場上，EPA的主要產(chǎn)品是以保健食品上市的含EPA和DHA魚油的明膠軟微膠囊，另外還有以醫(yī)藥品上市的甲酯膠囊和乙酯膠囊，EPA 含量可達60%以上。絕大多數(shù)的植物油中不含EPA，天然EPA的來源主要為海產(chǎn)魚類、貝類和一些海藻類，如海狗油、海豹油、金槍魚、沙丁魚、白蛤等。其加工原料主要采用海產(chǎn)魚油，由于魚油來源容易受季節(jié)、氣候等環(huán)境因素影響，且過多捕獵會破壞海洋生態(tài)平衡，所以無法滿足市場對EPA產(chǎn)量的要求，開發(fā)新來源成為目前學(xué)者關(guān)心的問題。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA不受自然條件影響，作為EPA原料來源明顯優(yōu)于魚類等資源，是取代魚油原料的最佳選擇。目前已發(fā)現(xiàn)含有EPA的微生物種類有真菌、海水細菌、藻類等。真菌在自然界分布廣且易培養(yǎng)，所以從真菌中選育EPA高產(chǎn)菌株前景廣闊。含EPA真菌主要為多種低等菌，如被孢霉、腐霉、蟲霉、壺菌等。目前已在高山被孢霉(Mortierella alpina)，長孢被孢霉，樟疫霉(Phytophthora ciaoamrnni)，終極腐霉(Pythiumultimum)，輪梗霉(Diasporangium sp.)，腐霉(Pythium)，畸雌腐霉(Pythium irregulare)，刺腐霉(P. spinosumSawada)等真菌中發(fā)現(xiàn)含有EPA。其中，腐霉是一種絲狀真菌，菌體內(nèi)的油脂中含有不飽和脂肪酸，尤其是 EPA含量較高，是生產(chǎn)EPA的良好菌種。目前含EPA菌種的篩選方法是從土壤中獲得大量菌株后，通過油脂提取和脂肪酸分析來確定生產(chǎn)菌株，其方法耗時長、工作量大。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供，其方法步驟簡單、 周期短，能有效快速地獲得二十碳五烯酸高產(chǎn)菌株。本專利技術(shù)所提出的二十碳五烯酸生產(chǎn)菌株的篩選方法，具體步驟包括步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)將采集的土樣置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，噴適量無菌水保持濕度，將經(jīng)滅菌的誘物塊按每皿1 5塊均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的土樣上，使誘物部分埋于土內(nèi)，培養(yǎng)見誘物上有菌絲長出，將菌絲移植到含硫酸鏈霉素600單位/ml和青霉素鈉鹽1000單位/ ml的PDA培養(yǎng)基平板上25°C培養(yǎng)2天；所述土樣采集于菜園或果園5 15cm深處；所述的誘物塊為1公分大小的黃瓜、土豆、黃豆、花生和胡蘿卜塊的任一種或是幾種；步驟二、分離純化采用稀釋涂布法對培養(yǎng)菌體進行分離純化，直至得到純菌株， 將得到的菌株采用PDA培養(yǎng)基斜面保種，編號保存；步驟三、初步篩選將純化菌株從斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹II與蘇丹 IV混合液染色5分鐘，用水沖洗后取染色的菌絲置于載波片上顯微鏡觀察；選取脂肪粒大而多的菌株為初篩菌種并確定其編號；所述蘇丹II與蘇丹IV混合液的配制用30ml的丙酮與乙醇等體積混合液振蕩溶解Ig蘇丹II后，靜置24小時以上，取上清液或者過濾液；以同方法配制蘇丹IV染液，將蘇丹II染液與蘇丹IV染液等體積混合；步驟四、復(fù)篩將初篩菌種采用PDA固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，得到的孢子采用液體培養(yǎng)基再次擴大培養(yǎng)；收獲菌絲烘干后研磨，用石油醚提取油脂，經(jīng)甲酯化后進行氣相色譜分析，選取EPA含量高的菌株確定編號，完成EPA高產(chǎn)菌株的篩選；所述液體培養(yǎng)基的組成為 葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鈉lg/L，硫酸鎂0. 5g/L。 采用本專利技術(shù)篩選到EPA含量較高的菌株，其中編號SW-43的菌株經(jīng)菌落菌絲形態(tài)、 生理生化及ISSrDNA鑒定為華麗腐霉。本專利技術(shù)通過誘導(dǎo)方法獲得菌絲，先采用蘇丹染色法挑選脂肪含量高的菌株，再進行氣相色譜分析確定EPA高產(chǎn)菌株，快速有效地篩選到二十碳五烯酸產(chǎn)量高的真菌菌株，方法步驟簡單、篩選周期短，而且所篩選菌株的花生四烯酸含量低、繁殖快、易培養(yǎng)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，對擴大EPA的微生物來源及其商業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。附圖說明附圖1為采用本專利技術(shù)方法篩選得到的SW-43號菌株脂肪酸甲酯的氣相色譜圖， 橫坐標為保留時間(min)，縱坐標為電壓值(mv)，經(jīng)與標準品對照，EPA甲酯的出峰時間為 17.90min，含量11. 13%。附圖2為SW-43號菌株脂肪酸甲酯質(zhì)譜圖，橫坐標為質(zhì)荷比(m/ ζ)，縱坐標為電壓值(mv)，經(jīng)過NIST02版標準譜庫檢索，附圖1色譜圖中17. 90mi η峰的質(zhì)譜圖與NIST中EPA甲酯質(zhì)譜圖主要的碎片離子峰完全一致，因此確認該成分為EPA甲酯。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本專利技術(shù)技術(shù)方案進行詳細說明。其中，1. PDA培養(yǎng)基參見，為 馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15 20g/L，水IOOOml ；2. PDA培養(yǎng)基中加入抗生素方法在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50°C 60°C時，將注射用硫酸鏈霉素和青霉素鈉鹽溶解后加入到培養(yǎng)基中，攪拌均勻后倒成平皿培養(yǎng)基；使培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素600單位/ml、青霉素鈉鹽1000單位/ml ；3.蘇丹II與蘇丹IV混合液的配制和液體培養(yǎng)基組成與前述方法相同。4.篩選出菌株的編號為SW-XX，其中SW意為陜西省微生物研究所。實例1、( 土樣采集于湖北武漢花山鎮(zhèn)絲瓜菜地5 15cm深處)步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分離純化將采集的土樣分成10份，每份均攤在無菌平皿中， 噴適量無菌水至土樣濕潤；另將約1公分大小的誘物塊(土豆塊)煮熟；涼后按每皿5塊均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的土樣上，使誘物部分埋于土內(nèi)，培養(yǎng)見誘物上有菌絲長出，立即將菌絲移植到含抗生素的PDA培養(yǎng)基平板上25°C培養(yǎng)2天；采用稀釋涂布法對長出的菌株進行分離純化，直至獲得純菌株；將得到的菌株采用PDA培養(yǎng)基斜面保種，并編號保存；步驟二、初步篩選按編號從PDA斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹II與蘇丹 IV混合液染色5分鐘，用水沖洗3次，挑少量菌絲置于載波片，用400倍顯微鏡觀察菌絲，選取脂肪粒大而多的菌株(菌絲體內(nèi)脂肪粒被染成紅色)為初篩菌種并確定其編號(對初篩出菌種可以重新編號，并斜面保種)； 步驟三、復(fù)篩將初篩菌種接種至PDA培養(yǎng)基斜面上，擴大培養(yǎng)3 5天后，用IOml 無菌水洗脫斜面上孢子，用接種鉤打散后把含孢子的水溶液倒入液體培養(yǎng)基中，于25°C、 180轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)5天；收獲菌絲，抽濾后，蒸餾水洗3遍，80°C烘干至恒重；用研缽把菌絲研成粉末，稱取Ig菌粉置于離心管，用3ml石油醚(30 60沸程)抽提2次，蒸干溶齊U，測定油脂含量。取油脂0. 05g置于具塞試管中，加入0. 5mol/L的KOH甲醇溶液lmL，60°C 水浴中皂化15min，冷卻后加入14%三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml，于60°C水浴中振蕩2min， 冷卻后加入正己烷Iml振蕩，再加入飽和氯化鈉溶液1ml，靜置后取上清液進行氣相色譜分析(脂肪酸甲酯)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
１．一種二十碳五烯酸生產(chǎn)菌株的篩選方法，其特征在于，具體包括：步驟一、誘導(dǎo)培養(yǎng)：將采集的土樣置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，噴適量無菌水保持濕度，將經(jīng)滅菌的誘物塊按每皿１～５塊均勻放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的土樣上，使誘物部分埋于土內(nèi)，培養(yǎng)見誘物上有菌絲長出，將菌絲移植到含硫酸鏈霉素６００單位／ｍｌ和青霉素鈉鹽１０００單位／ｍｌ的ＰＤＡ培養(yǎng)基平板上２５℃培養(yǎng)２天；所述土樣采集于菜園或果園５～１５ｃｍ深處；所述的誘物塊為１公分大小的黃瓜、土豆、黃豆、花生和胡蘿卜塊的任一種或是幾種；步驟二、分離純化：采用稀釋涂布法對培養(yǎng)菌體進行分離純化，直至得到純菌株，將得到的菌株采用ＰＤＡ培養(yǎng)基斜面保種，編號保存；步驟三、初步篩選：將純化菌株從斜面中挑取菌絲于試管中，加入蘇丹ＩＩ與蘇丹ＩＶ混合液染色５分鐘，用水沖洗后取染色的菌絲置于載波片上顯微鏡觀察；選取脂肪粒大而多的菌株為初篩菌種并確定其編號；步驟四、復(fù)篩：將初篩菌種采用ＰＤＡ固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，得到的孢子采用液體培養(yǎng)基再次擴大培養(yǎng)；收獲菌絲烘干后研磨，用石油醚提取油脂，經(jīng)甲酯化后進行氣相色譜分析，選取ＥＰＡ含量高的菌株確定編號，完成ＥＰＡ高產(chǎn)菌株的篩選。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧美歡，李利軍，馬英輝，
申請(專利權(quán))人：陜西省微生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：87
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