本發明專利技術公開了一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其應用。PPP2R5C-siRNA799的正義鏈為5’-GCAUAGCAGAGUUACUGGAAAUAUU-3’；反義鏈為5’-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3’。PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表達，mRNA的下調程度達到2～4倍，蛋白表達明顯得到抑制；同時其能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖。本發明專利技術所提供的siRNA對于開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應用前景和經濟價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種siRNA，特別涉及一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C-siRNA799及其應用。
技術介紹
血液腫瘤是發病率較高的惡性腫瘤之一，每年全國約有10萬初發病人，嚴重危害人們、尤其是青少年的健康。T細胞腫瘤是血液腫瘤的一種主要類型，主要由于T細胞惡性克隆增殖而形成，包括多種類型的T細胞白血病和淋巴瘤，多數惡性程度高，治療效果差， 預后不良。臨床治療上一直存在難治療、耐藥和易復發等難題，因此尋找更有效和特異的治療方案一直是研究者的一個重要目標。隨著對腫瘤細胞分子特點的逐漸明確，不斷發現腫瘤T細胞特異的分子，設計和研制有效的靶向治療藥物，成為提高T細胞腫瘤治療效果的一個重要手段。PPP2R5C基因是在1996年被發現并克隆出來的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的一個亞單位，在調節細胞增殖、分化和轉化等過程中具有重要作用，目前研究認為其屬于一種抑癌基因。近期研究提示其表達模式的改變與細胞惡性轉化相關，我們的前期研究也發現 PPP2R5C在T細胞腫瘤中有異常高表達情況。近年來，利用RNA干擾技術，將化學合成的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)轉導至特定的細胞，沉默相關基因的表達，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治療最有吸引力的方法之一。選擇特異性的靶基因合成有效的siRNA，并且選擇合適轉染方式，使其在宿主細胞中高效作用，是實施這一靶向治療措施的重點。靶向針對 PPP2R5C基因的siRNA序列對于開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應用前景和經濟價值。
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于提供一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的 siRNA，名稱為 PPP2R5C-siRNA799。本專利技術的另一目的在于提供上述PPP2R5C_siRNA799的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現一種靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T 細胞增殖的PPP2R5C-siRNA799，核糖核苷酸序列如下所示正義鏈5，-GCAUAGCAGA⑶UACUGGAAAUAUU-3，；反義鏈5，-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3，。所述的靶向抑制PPP2R5C基因表達和腫瘤T細胞增殖的PPP2R5C_siRNA799用于制備抑制PPP2R5C基因表達的制劑。所述靶向抑制PPP2R5C基因表達的siRNA應用于制備治療T細胞腫瘤的藥物。所述T細胞腫瘤為T細胞白血病。本專利技術相對于現有技術具有如下的優點及效果1、本專利技術所提供的PPP2R5C-siRNA799能高效抑制PPP2R5C基因的表達，mRNA的下調程度達到2 4倍，蛋白表達明顯得到抑制，如圖2和圖3所示。2、本專利技術所提供的PPP2R5C-siRNA799能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖，如圖4所7J\ ο3、本專利技術所提供的PPP2R5C_siRNA799對于開發新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，其具有很大的應用前景和經濟價值。附圖說明圖1是實施例1中通過流式細胞儀檢測Molt-4細胞轉染效率圖，其中A為轉染Alexa Red Oligo的柱形圖；B為對照組的柱形圖。圖2是實施例2的實驗組和對照組的實時定量PCR結果圖。圖3是實施例2的實驗組和對照組的Wfestern Blot圖(RNA干擾后48h)。圖4是通過Armexin V/PI雙染后流式細胞儀得到的實驗組和對照組的細胞凋亡圖。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。實施例1SiRNA的合成和轉染T淋巴細胞白血病細胞株(Molt_4)(購自中科院上海細胞所)細胞條件的穩定，具體步驟如下(1)設計和得到siRNA在 GenBank (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)里查找 PPP2R5C 基因序列(ACCESSION NM 178587)，然后根據 hvitrogen 公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth RNAi設計法則，在線設計針對PPP2R5C的siRNA。本專利技術所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表達的siRNA是從PPP2R5C基因序列799bp開始的25nt siRNA (稱為siRNA-799)，同時設計與目的基因序列無同源性的無關序列siRNA (non-silencing scrambled control, SC,25nt)為對照組，siRNA均由美國hvitrogen公司化學合成。siRNA-799 的序列如下正義鏈序列5，-GCAUAGCAGA⑶UACUGGAAAUAUU-3，；反義鏈序列5，-AAUAUUUCCAGUAACUCUGCUAUGC-3，。無關序列siRNA的序列如下正義鏈序列5，-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3，；反義鏈序列5，-UUACUGG⑶UAAGCUAGGUAGACUA-3，。(2)準備處于對數生長期的Molt-4細胞將Molt-4細胞接種于含體積分數10%新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，在含體積百分數5% CO2的培養箱37°C連續培養，2 3天傳代PPP2R5Ci5 丨-GTAATAAAGCGGGCAGCAGG -3 ‘PPP2R5Cb5'- C AAAGTC AAAGAGGACGCAACA -3 ‘β2Μ5'- CAGCAAGGACTGGTCTTTCTAT -3 ‘β2Μ5'- GCGGCATCTTCAAACCTC -3 ‘表2 實時定量PCR檢測轉染后PPP2R5C基因mRNA水平變化一次，得到處于對數生長期的Molt-4細胞。(3) PPP2R5C-siRNA799 轉染 Molt-4 細胞A、收集2. 5 X IO6個Molt-4細胞，200g離心lOmin，完全去除上清；B、用 100 μ 1 預熱至室溫的 Nucleofector Solution 和 Supplement 混合液 (Amaxa，德國)懸浮細胞；C、加入 IOOnM Alexa Red Oligo (Invitrogen，美國)，混勻后加入核轉杯(Amaxa, 德國)，啟動Molt-4特異性程序C-005 ；同時設置對照組，對照組與轉染Alexa Red Oligo 的步驟相同，但是沒有加入Alexa Red Oligo ；D、程序完成后立刻用核轉染試劑盒(Amaxa，德國)里配套的移液器將轉染后的細胞液接種于培養瓶中，終體積為5ml ；E、放入培養箱10小時后利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光值，分析轉染效率。通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測的結果如圖1所示，可見通過上述轉染方法的轉染效率穩定在56. 2 士 14. 14%。實施例2將siRNA-799轉染Molt-4細胞后，檢測PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水平的表達， 明確其干擾效應。(1)實驗分組實驗組為轉染siRNA-799，對照組分別為無關序列對照組(SC)、轉染條件對照組(MOCK)和空白對照組(NC)，實驗方法同實施例1步驟(本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種靶向抑制ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ基因表達和腫瘤Ｔ細胞增殖的ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ－ｓｉＲＮＡ７９９，其特征在于：其核糖核酸序列如下：正義鏈：５’－ＧＣＡＵＡＧＣＡＧＡＧＵＵＡＣＵＧＧＡＡＡＵＡＵＵ－３’；反義鏈：５’－ＡＡＵＡＵＵＵＣＣＡＧＵＡＡＣＵＣＵＧＣＵＡＵＧＣ－３’。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李揚秋，陳宇，鄭海濤，楊力建，陳少華，沈琦，劉思初，李萡，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：81
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