一種使用核－殼型納米顆粒從蛋白質制備物中去除內毒素的方法，所述核－殼型納米顆粒具有選擇性地吸附蛋白質混合物中的內毒素分子的能力。所述方法包括如下步驟：（ａ）制備多個核－殼型納米顆粒；（ｂ）將所述核－殼型納米顆粒添加到含有內毒素的蛋白質制備物中；（ｃ）將所述核－殼型納米顆粒與所述蛋白質制備物一起溫育一段時間；和（ｄ）從所述蛋白質制備物中分離出納米顆粒。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及從蛋白質制備物(proptein preparation)中去除內毒素的方法。具體地說，本專利技術涉及使用兩親核-殼型納米吸附劑(amphiphilic core-shell nanosorbent) 從蛋白質混合物中選擇性地去除內毒素的方法。
技術介紹
內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)來自大部分革蘭氏陰性細菌(包括大腸桿菌(Escherichia coli))的細胞壁，并且經常在蛋白質生成的過程中大量存在。由于少量內毒素的存在可以對動物造成嚴重的炎癥和膿毒性休克，因此蛋白質藥物的LPS水平應當低于10EU/mL，以確保該藥物通過靜脈注射的安全使用。目前降低內毒素的手段主要基于帶正電的吸附劑和帶負電的內毒素之間的靜電相互作用。例如，過濾、陽離子交換層析、Triton X-114相分離、陽離子聚合物吸附劑(如組胺-或組氨酸-固定化瓊脂糖(kpharose)和葡聚糖包被顆粒是常用的方法。然而，這些方法在將內毒素從含有其他酸性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)的蛋白質溶液中去除時選擇性欠佳。選擇性欠佳的原因在于，酸性蛋白質和內毒素在中性PH時具有相同的負電荷， 因而通過靜電相互作用進行的吸附無法區分不同的酸性蛋白質，導致目標酸性蛋白質的大量損失。為了選擇性地只吸附蛋白質混合物中的LPS，而不吸附其他蛋白質，Miltenyi Biotech.研發了一類包被有多陽離子配體的磁性顆粒(它們的具體化學組成沒有公開)。 據稱所述顆粒能夠從BSA溶液中選擇性地吸附LPS，LPS的去除效率高達99%，而BSA的回收率為96%。然而，如此高的選擇性只能在相對較低的緩沖強度(例如0. IM磷酸鹽緩沖液， PH 7)和特定的緩沖液類型(磷酸鹽緩沖液)中實現。對于其他緩沖溶液如在50mM Tris 緩沖液(PH 7)，盡管仍然可以實現高的LPS去除效率，但是蛋白質回收率顯著降低到67%。 實現選擇性去除LPS的另一種手段是使用多粘菌素B-固定化柱。其選擇性能歸因于脂質 A與LPS分子之間的疏水性相互作用。然而，該方法在采用小樣品體積時蛋白質損失嚴重。 由在表面上固定有陽離子配體如多粘素B、聚-L-賴氨酸和多(乙烯亞胺)的尼龍制得的微濾膜也有用來選擇性地去除LPS。盡管聚合物包被膜可以得到滿意的吸附性能并對內毒素表現出選擇性，但是它們良好的性能限于低鹽濃度(例如0.02M磷酸鹽緩沖液)。另外，多粘素B在LPS吸附過程中的滲漏問題是一種嚴重的問題，這是因為多粘素B對動物具有神經毒性和腎毒性。該方法的另一個問題是過濾器封堵，這是與微濾膜使用有關的一個常見問題。因此，仍然非常需要能夠在緩沖溶液的大范圍的PH、鹽濃度和類型下在酸性或堿性蛋白質溶液存在的情況下選擇性地并有效地去除內毒素的方法。Chisso Corp.公開了由聚賴氨酸固定化纖維素多孔性微球制成的吸附劑(Chisso Corp. :Cellufine ET clean)。這些吸附劑在生理緩沖液(離子強度為0. 1至0. 5M，pH7) 下表現出滿意的LPS吸收能力和選擇性。這些材料的成功歸因于兩個主要特征選擇性內毒素結合配體聚賴氨酸和多孔性結構的存在。多孔性結構的存在為選擇性吸收和捕獲LPS 分子提供了大的表面積和適當的孔徑尺寸，這是因為內毒素分子小到足以擴散到顆粒小孔中，并保留在微球內。較大尺寸的蛋白由于它們的尺寸大于微球小孔的排阻限而被迅速洗脫。然而，由于多孔性纖維素微球采用隨機懸浮交聯法制備，它們的顆粒和孔徑不均一，造成再現性欠佳。另外，該方法包括多步驟表面修飾并采用昂貴的試劑如聚賴氨酸。使用多孔性材料經常碰到的另一個問題是緩慢的LPS吸附動力學，這是因為LPS必須從外部環境擴散到微球的小孔中以進行吸附。因此，該方法非常耗時(批量方法需要2小時的溫育時間)。作為親和層析法，當將微球填充到柱子中時，必須保持緩慢的流速(0. 17mL/min (毫升 /分鐘)至0. 5mL/min)以實現LPS的高效去除。最近，據^an等報道，在使用一種含有在鄰近季銨離子的β位帶有羥基的配體的吸附劑時，內毒素的吸附能力在PH小于7時能夠提高近8倍。該顯著改善歸因于內毒素分子的磷酸基團的氫原子和羥基的氧原子之間的強的氫鍵結合。所述氫鍵結合導致八元環的形成。然而，由于配體和吸附劑的接枝密度低，該方法得到的LPS吸附效率難以滿意。 另外，針對LPS的最佳工作pH必須低于pH 7，因而限制了蛋白質的范圍。因此，一直非常需要克服上述問題的去除內毒素的新方法。
技術實現思路
因此，本專利技術的一個目的是提供一種以高選擇性和高效率從蛋白質制備物中去除內毒素的方法，并且所述方法在緩沖溶液的寬范圍的pH、鹽濃度和類型下在酸性或堿性蛋白質溶液中進行。該目的通過使用兩親核-殼型納米吸附劑來實現，所述兩親核-殼型納米吸附劑具有選擇性吸附在蛋白質混合物中的內毒素的能力。盡管無意受特定理論的束縛， 但是據信所述納米吸附劑包含乙烯基聚合物的核或乙烯基聚合物和磁性納米顆粒的核，和含有在鄰近季銨離子的羥基的陽離子水溶性聚合物的殼(如圖1所示)。所述兩親核-殼型納米吸附劑具有高的內毒素結合能力，該能力歸因于各種分子相互作用(如疏水性和靜電相互作用)以及氫鍵結合。在本專利技術中描述的去除內毒素的所述方法包括在納米吸附劑存在下溫育蛋白質溶液，然后進行磁性分離或過濾。經純化的蛋白質溶液具有非常低的內毒素水平，因而允許進行進一步的處理、分析或者甚至直接施用于動物。優選的是，根據本專利技術的去除內毒素的方法包括如下步驟(a)制備多個核-殼型納米顆粒；(b)將所述核-殼型納米顆粒添加到含有內毒素的蛋白質制備物中；(c)將所述納米顆粒與所述蛋白質制備物一起溫育一段時間；(d)從所述蛋白質制備物中分離出納米顆粒。所述蛋白質制備物可以在由本領域普通技術人員所選擇的任何適當的緩沖液中。適當緩沖液的的實例為乙酸鹽緩沖液、磷酸鈉緩沖液、TRISUXPBS等。所述蛋白質制備物的電解質濃度可以具有寬的范圍(優選為IOmM)，并且可以與生理值相同。所述蛋白質制備物還可以具有寬范圍的PH值，例如3至10。附圖說明圖1是本專利技術中使用的磁性核-殼型納米吸附劑的結構的示意圖。圖2顯示了制備本專利技術中使用的磁性核-殼型納米吸附劑時的合成步驟。圖3是顯示根據本專利技術使用磁性核-殼型納米吸附劑去除內毒素的程序的示意圖。具體實施例方式核-殼型納米吸附劑本專利技術方法使用一類核-殼型納米吸附劑，所述核-殼型納米吸附劑已經在專利申請(美國專利申請No. 12/359,393)中公開。所述兩親核-殼型納米吸附劑具有選擇性吸附蛋白質混合物中的內毒素分子的能力。如圖1所示，所述納米吸附劑包含乙烯基聚合物的核或乙烯基聚合物和磁性納米顆粒的核，和含有在鄰近季銨離子的β -羥基的陽離子水溶性聚合物的殼。所述殼可以通過各種特制(tailor-made)分子相互作用而選擇性地結合內毒素分子。在該納米吸附劑中使用的核材料包括諸如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚 (丙烯酸正丁酯)等疏水性乙烯基聚合物，還包括乙烯基聚合物的混合物。所述核還可以是交聯親水性聚合物如聚(N-異丙基丙烯酰胺)。出于隨后在磁場分離納米吸附劑的目的，磁性納米顆粒可以包封在疏水性核中。磁性納米顆粒具有式本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種從混合物中去除內毒素的方法，所述方法包括如下步驟：（ａ）獲得多個核－殼型納米顆粒；（ｂ）將所述核－殼型納米顆粒添加到含有內毒素的蛋白質制備物中；（ｃ）將所述納米顆粒與所述蛋白質制備物一起溫育一段時間；和（ｄ）從所述蛋白質制備物中分離出納米顆粒。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：李蓓，
申請(專利權)人：香港理工大學，
類型：發明
國別省市：HK
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