本發明專利技術涉及醫學檢驗測定技術領域，特別是一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。它通過構建一種基于胱硫醚合成酶-胱硫醚裂解酶-乳酸脫氫酶偶聯、可消除內源性胱硫醚干擾的同型半胱氨酸測定新體系，實現對同型半胱氨酸的準確測定和測定結果真實的目的。并依據該法構建的同型半胱氨酸測定試劑置2-8℃保存可穩定14個月，可以應用于目前廣泛使用的臨床生化自動分析儀，滿足大規模測定樣本的要求。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫學檢驗測定
，特別是一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。
技術介紹
血清/漿同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是一種含硫分子的氨基酸，在身體內經由甲硫氨酸(methionine)代謝后而得到的中間代謝產物。眾多臨床資料已經證實HCY 是心臟冠狀動脈硬化、心肌梗塞、腦中風和末梢血管阻塞的重大危險因子。長久以來，醫學上都認為心臟疾病與膽固醇增加有關，但是卻仍有25%的心臟病患者在體內沒有明顯的膽固醇或其它危險因子升高的現象。上世紀60年代末期，一些學者注意到患有遺傳性高胱氨酸尿癥的病人，大多數伴有亞臨床心血管病。1976年，Wichen等通過流行病學調查提出同型半胱氨酸是心血管病人一個獨立危險因素，但一直未受到人們重視。近年來的研究發現， 同型半胱胺酸HCY的代謝與心血管疾病或中風有極大關聯。動物試驗表明，應用3%蛋氨酸飲食長期喂養家兔，誘發同型半胱氨酸血癥，家兔血中甘油三酯、游離脂肪酸、脂質過氧化物含量均明顯升高，病理檢查表明主動脈脂肪大量沉積，并發生動脈粥樣硬化。Glueck等報道，他們對482例高血脂病人進行分析，18例患者同時伴有血漿同型半胱氨酸含量升高。其中13人患有動脈粥樣硬化，發病率為72%，遠高于血漿同型半胱氨酸含量正常的高血脂患者。在18例高同型半胱氨酸血癥患者的直系親屬中動脈粥樣硬化的發病率可達78%。目前，HCY對心血管疾病的診斷意義已被臨床充分重視。由于同型半胱氨酸測定對心血管疾病的診斷有較好的特異性和靈敏度，在近20 年中，測定方法得到不斷開發和改進。主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光偏振免疫測定法(FPIA)、酶聯免疫分析法(ELISA)、毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)等。這些方法需要對HCY進行衍生和復雜的樣品前處理，同時需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規分析。 近幾年來，利用酶法測定HCY的方法得到了開發和改進，目前臨床上主要應用美國Teco Diagnostics公司的Homocysteine Reagent (下稱"iTeco法”)進行HCY的測量，該法通過循環酶反應將HCY轉化為丙酮酸鈉，然后用測定丙酮酸鈉的方法對HCY進行定量，此法靈敏度高，可應用于臨床廣泛使用的全自動生化分析儀，從而實現HCY的自動化分析，但該法無法排除內源性胱硫醚干擾，易使HCY測定結果假性升高。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種能夠消除內源性胱硫醚干擾，測定結果真實、準確的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。為了達到上述目的，本專利技術采用以下技術解決方案一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、還原性輔酶I (NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)、海藻糖的pH8. 50-9. OOTris-HCl緩沖液為試劑I，按一定比例加入含內源性干擾物質胱硫醚的待測同型半胱氨酸(HCY)血清樣品，監測340nm處吸光度的降低值，與標準液對照后計算出由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Chc^1 ；(2)配制含絲氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7. 50-7. 80Tris_HCl緩沖液為試劑II，將試劑II按一定比例加入到第(1)步試劑I和待測血清樣品的混合溶液中，監測340nm處吸光度下降速率，與標準液對照后計算出同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2 ；(3)將第( 步所測得的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2減去第(1)步所測得的同型半胱氨酸濃度Chc^1得血清同型半胱氨酸(HCY)濃度C血清hcy °步驟(1)中的反應條件為在37°C環境中反應180-600秒；步驟O)中的反應條件為在37°C環境中反應90-480秒。步驟(1)中，所述血清樣品與所述試劑I的體積比為V血清Vwji = 16.5 250 ；步驟⑵中，所述血清樣本與所述試劑I、試劑II的體積比為Vtt Vwji V試 ^ijii = 16. 5 250 50。步驟⑴中，所述試劑I中各物質最適濃度為pH8. 50-9. OOTris-HCl濃度為 30-100mmol/L，所述胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L，所述還原性輔酶I (NADH)濃度為4-6g/L，所述乳酸脫氫酶(LDH)濃度為30-100KU/L，所述海藻糖濃度為20_100g/L ；步驟⑵中，所述試劑II中各物質最適濃度為pH7. 50-7. SOTris-HCl濃度為50-200mmol/L，所述絲氨酸濃度為2. 5-10mmol/L,所述胱硫醚合成酶(CBQ濃度為 30-80KU/L，所述海藻糖濃度為20-100g/L。步驟(1)中，所述的由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Chc^1的計算公式為= ，其中Au為步驟⑴樣品吸光度值，AS為步驟 (1)同體積的標準液代替樣品所測得的吸光度值，Atl為步驟(1)同體積的去離子水代替樣品所測得的吸光度值，為標準液中胱硫醚的濃度。步驟O)中，所述的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2的計算公式為Ch。y,2 = X ((^準脅+(^準胱硫醚)，其中 A Au/min 為步驟⑵樣品每分鐘吸光度變化值，AAsAiin為步驟O)同體積的標準液代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值，AAtlAiin為步驟(2)同體積的去離子水代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值， Cs ih。y為標準液中同型半胱氨酸(HCY)的濃度，為標準液中胱硫醚的濃度。為了達到上述目的，本專利技術還采用以下技術解決方案一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定試劑，其特征在于測定試劑由試劑I和試劑II組成，試劑I中的ρΗ8· 50-9. OOTris-HCl濃度為30-100mmol/L,含有的胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L、還原性輔酶I(NADH)濃度為4_6g/L、乳酸脫氫酶(LDH)濃度為30-100KU/ L、海藻糖濃度為 20-100g/L ；試劑 II 中的 pH7. 50-7. 80Tris-HCl 濃度為 50-200mmol/L，含有的絲氨酸濃度為2. 5-lOmmol/L、胱硫醚合成酶(CBQ濃度為30-80KU/L、海藻糖濃度為 20-100g/L。本專利技術通過構建一種基于胱硫醚合成酶(CBQ-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脫氫酶 (LDH)偶聯、可消除內源性胱硫醚干擾的同型半胱氨酸測定新體系，實現同型半胱氨酸的準確測定。該法在測定同型半胱氨酸之前，血清內源性干擾物質胱硫醚在步驟(1)經胱硫醚裂解酶(CBL)作用后轉化為同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)作用下將還原性輔酶I (NADH)轉化為氧化性輔酶I (NAD+)，還原性輔酶I (NADH)在340nm有最大吸收，通過監測340nm處吸光度的降低值，可計算出由內源性干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度；在步驟O)中通過胱硫醚合成酶(CBQ-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脫氫酶(LDH)偶聯途徑測得總同型半胱氨酸(HCY)濃度后，減去由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度，即為消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸濃度。依據該法構建的同型半胱氨酸(HCY)測定試劑置2-8°C保存可本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳光永，
申請(專利權)人：溫州市德福泰生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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