本發明專利技術屬于生物技術領域，涉及哺乳動物的胚胎腎臟的體外器官培養方法，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養。本發明專利技術要解決的技術問題主要是現有培養方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本發明專利技術技術方案是胚胎腎臟的體外器官培養方法，包括以下步驟：a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的交界處；c、37℃培養箱中培養，然后每1到2天進行培養基換液。使用本發明專利技術方法能大量低成本地獲得穩定發育且便于后繼操作的體外培養腎臟器官，還能滿足大規模藥物篩選的需求。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及哺乳動物的，特別是小鼠胚胎期腎臟的離體器官培養。
技術介紹
體外器官培養屬于組織培養的一種高級形式，它能再現器官的發育過程，模擬器官在不同狀態及條件下的功能狀態，是是了解器官發育過程，研究疾病致病機制及藥物篩選的重要技術手段。目前腎臟體外器官培養目前有由Mxen L等于1966年發表于雜志 InternationalJournal of Cancer _t Cell contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15 ； 1 (3) :271-90. —文中，他們利用 3. 5cm 培養皿，放入 2ml 培養基，將孔徑5um左右的聚碳酸脂濾膜漂在培養基上或者用不銹鋼網做支架支撐。然后將小鼠胚胎腎臟放置于濾膜上，置于氣液交界處培養(參見附圖1、圖幻。最新的是2010 年，Jamie A. Davies 在雜志 PLoSOne 中發表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonic kidneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization 2010Mayl0 ；5 (5) :el0550. 一文提出了小體積培養方法。同樣是利用3. 5cm培養皿，改進之處在于利用孔底面積1平方厘米的硅膠圈和22mmX22mm的玻璃片組裝培養孔，將胚胎腎臟直接培養在玻璃片上，加入85ul體積培養基培養，硅膠圈和培養皿之間的空隙用帶抗生素的磷酸鹽緩沖液填充維持培養皿濕度(參見附圖3、圖4)。但是上述兩種方法均受到使用需要使用特殊材料和占用較大空間限制，另外也未考慮到培養基體積和成分變化對腎臟培養產生的影響，阻礙了胚胎腎臟的體外器官培養技術的大規模應用以及其在藥物篩選中的運用。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題主要是現有培養方法需要特殊材料和占用空間大的缺陷。本專利技術解決技術問題提供的技術方案是提供一種哺乳動物。該方法包括以下步驟a、在多孔培養板的培養孔中放入尺寸與之適配的承載片，在培養孔底部構建出培養空間；b、將取得的哺乳動物胚胎腎臟放置于承載片上，加入培養基，使腎臟處于培養基和空氣的液-氣交界處；c、37°C培養箱中培養，然后每1到2天進行培養基換液。其中，上述方法步驟a所述的多孔培養板為M孔培養板。其中，上述方法中在在使用的多孔培養板的各孔間隙加入濕度平衡液，以減緩培養基揮發。其中，上述方法步驟b中加入培養基后調整承載片于培養孔的底部的中心，哺乳動物胚胎腎臟或胚胎腎臟原基位于承載片的中部。其中，上述方法c步驟中所述的培養基采用半量遞增的方式換液，即每次換液時保留上次培養基體積的一半在原培養孔中，然后將比上次培養基體積的一半按體積分數還多增加6% -12%的新鮮培養基加入培養孔。進行10天培養時，第1-2天按上次培養基體積的一半加入，第9-10天按上次培養基體積的一半加入最佳。其中，上述方法步驟a中所述的承載片為透明玻璃圓片。其中，上述方法中所述濕度平衡液為無菌的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水。其中，上述方法中所述胚胎腎臟為分離的胚胎期10 13天的小鼠腎臟原基。其中，上述方法中所述的腎臟放置方式為將腎臟平放。即輸尿管走向面與承載片平面平行的方式放置于承載片上。本專利技術方法的有益效果在于使用本專利技術方法進行胚胎腎臟的體外器官培養無需昂貴進口濾膜或者硅膠圈等進口材料，成本大大降低；克服了目前所有方法的占用空間大缺點，使用本專利技術放在運用利用M孔培養板可以將每個腎臟培養時的占用面積由38. 5平方厘米減少到1. 5平方厘米左右，大大提高了空間利用率；具有培養基用量少的優點，利用 M孔培養板時每孔只需150ul左右的培養基培養即可；體系組裝簡單，操作便捷，只需將處理好的承載片放入培養孔，放置胚胎腎臟，加入培養基培養即可，簡單易行且污染環節大大減少，有利于培養成功率的提高；培養結果良好，胚胎腎臟的培養時間能到10天以上，可提高到12天，并可見輸尿管平滑肌自主性收縮；使用承載片培養導致后續操作方便，可進行原位雜交，免疫熒光等后繼實驗操作操作。本專利技術方法還另外提供了一種優選的培養基后繼換液方案，使培養效果更好，體外器官發育更加穩定。本專利技術方法能大量低成本地獲得穩定發育且便于后繼操作的體外培養腎臟器官，還能滿足大規模藥物篩選的需求。附圖說明圖1、傳統的胚胎腎臟體外器官培養兩種方法的體系示意圖之一。1、培養基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網支架。圖2、傳統的胚胎腎臟體外器官培養兩種方法的體系示意圖之二。1、培養基；2、聚碳酸脂濾膜；3、.胚胎腎臟原基；4、不銹鋼網支架。圖3、已報導的小體積胚胎腎臟體外器官培養體系(培養皿)示意圖，示縱剖面。1、培養基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1XPBS。圖4、已報導的小體積胚胎腎臟體外器官培養體系(培養皿)示意圖，俯視。1、培養基；2、硅膠圈；3、胚胎腎臟原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1X PBS。圖5、本專利技術的培養方法采用的胚胎腎臟體外器官體系示意圖。1、培養基；2、承載片；3、胚胎腎臟；4、培養孔；5、濕度平衡液，6M孔培養板。圖6.本專利技術的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養裝置1.培養基；2.承載片；3.胚胎腎臟；圖7.本專利技術的承載片-多孔平板法的胚胎腎臟體外器官培養裝置1.培養基； 2.承載片；3.胚胎腎臟；圖8、本專利技術的培養方法使用M孔板時，優化的培養基換液體積方案。圖9、本專利技術方法胚胎腎體外培養效果及原位雜交和免疫熒光檢測。圖中第一、二排顯示的是小鼠胚胎期12. 5天的腎臟進行培養十天的效果圖，能看得見明顯的輸尿管分支及腎單位各階段前體結果的形成。培養效果良好，并可見輸尿管自主性收縮。第三排為分別用原位雜交(in situ)和免疫熒光檢測腎單位標志物PAX8和輸尿管及遠端小管標志物E-cadherin 型鈣粘附蛋白)的表達，黑色和白色分別顯示陽性信號，實驗結果證明了本專利技術方法培養的腎臟發育良好，可應用于多種方式檢測。圖10、用現有方法培養了 10天后免疫熒光檢測的結果，示輸尿管(來源于Jamie A. Davies 在雜志 PLoS One 中發表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonickidneys that allows development of cortico—medullary anatomical organization 20IOMay 10 ；5 (5) :el0550.)，本專利技術方法6天培養的結果就和其10天的培養結果基本一致。圖11、用本專利技術方法培養得到的體外培養胚胎腎臟的SiRNA轉染效果圖。該圖顯示用EGFP綠色熒光轉基因小鼠胚胎期10. 5和11. 5天取出的腎臟轉染CY5紅色熒光標記的siRNA效果圖，第一列為鏡下腎臟形態圖，第二列為綠色熒光表達圖，第三列為紅色熒光圖，兩張圖顯示了絕大部分細胞轉染進了 siRNA。具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：周欽，呂小巖，陳鐵林，孫環，魏于全，
申請(專利權)人：四川大學華西醫院，
類型：發明
國別省市：
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